Name: High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Scopri un saggio di fluorescenza per misurare l'attività dei canali del potassio Kir e identificare nuovi modulatori tramite screening ad alto rendimento. Questo metodo consente di testare migliaia di composti al giorno.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento del National Institutes of concede Salute 1R21NS073097-01 e 1R01DK082884 (JSD) e Fondazione per il National Institutes concessione PIER11VCTR.

<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Trattamento: Una volta che i dati sono raccolti, un passo comune consiste nell&#39;analisi normalizzare risposta di fluorescenza di ciascun pozzetto, F, al suo valore iniziale all&#39;inizio dell&#39;esperimento, F 0. Questo è comunemente indicato come &quot;rapporto statico&quot; e simboleggiato &quot;F / F 0&quot;. Nei casi in cui è dominato F 0 dal colorante indicatore dell&#39;operazione rapporto statico sarà sostanzialmente per correggere molti fattori qu...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Tetraciclina-inducibile vettore di espressione </td></tr><tr><td> T-REX-cellule HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Tetraciclina-inducibile linea cellulare </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Transfection reagente </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Cella cultura dei media </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Cella cultura dei media </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Cella cultura dei media </td></tr><tr><td> Blasticidina S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Cella cultura dei media </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Cella cultura dei media </td></tr><tr><td> HBSS-bivalente libero </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Cella di lavaggio </td></tr><tr><td> Tripsina 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Dissociazione cellulare </td></tr><tr><td> Tetraciclina-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Induzione reagente </td></tr><tr><td> Dializzato FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Placcatura dei media </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Colorante fluorescente </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Dye carico </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Assay Buffer </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Assay Buffer </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> D-Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> Solfato di tallio </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + stimolo tampone </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvente </td></tr><tr><td> Otto-canale elettronico pipetta </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Placcatura cella in 384 -pozzetti </td></tr><tr><td> BD PureCoat ammina rivestite piastre a 384 pozzetti </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Dosaggio micropiastre </td></tr><tr><td> Echo qualificato 384-Well polipropilene micropiastre (384PP) </td><td> Labcyte </td><td> P-05.525 </td><td> Composti di origine micropiastre </td></tr><tr><td> 384 pozzetti in polipropilene micropiastre </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi reagente dispenser </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> ELx405 Lavatore </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Cella di lavaggio automatico </td></tr><tr><td> Echo liquid handler </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo piattaforma automatizzata di gestione dei liquidi </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modello di serie </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic immagini lettore di piastre </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco dei materiali e reagenti.

high-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio inward rectifier

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Membri specifici della famiglia verso l&#39;interno canale del potassio raddrizzatore (Kir) sono postulato bersagli farmacologici per una varietà di disturbi, tra cui l&#39;ipertensione, fibrillazione atriale, e 1,2 dolore. Per la maggior parte, tuttavia, i progressi verso la comprensione il loro potenziale terapeutico o funzioni fisiologiche anche di base è stata rallentata dalla mancanza di buoni strumenti farmacologici. In effetti, la farmacologia molecolare della famiglia raddrizzatore verso l&#39;interno è rimasta molto indietro quella della superfamiglia S4 del potassio voltaggio-dipendenti (Kv) canali, per i quali un certo numero di nanomolare affinità e altamente modulatori selettivi tossine peptidi sono stati scoperti 3. Il tertiapin veleno d&#39;api tossina e suoi derivati ​​sono potenti inibitori del Kir1.1 e Kir3 canali 4,5, ma peptidi sono di uso limitato terapeuticamente nonché sperimentalmente a causa delle loro proprietà antigeniche e scarsa biodisponibilità, stabilità metabolica e penetranza tessuto. Lo sviluppo di potentie selettivi piccole molecole sonde con migliori proprietà farmacologiche sarà una chiave per comprendere appieno la fisiologia e la potenziale terapeutico dei canali Kir. La molecolare Biblioteche Sonde Produzione Centro connessioni di rete (MLPCN) supportato dal National Institutes of Health (NIH) Fondo comune ha creato opportunità per gli scienziati accademici di avviare campagne di sonda di rilevamento per target molecolari e vie di segnalazione che hanno bisogno di una migliore farmacologia 6. Il MLPCN fornisce ai ricercatori l&#39;accesso per l&#39;industria scala centri di screening e chimica farmaceutica e informatica sostegno per sviluppare piccole molecole sonde di chiarire la funzione dei geni e delle reti di geni. La fase critica l&#39;ammissione al MLPCN è lo sviluppo di un saggio robusto bersaglio o percorso specifico che è suscettibile di screening ad alto rendimento (HTS). Qui, descriviamo come sviluppare una fluorescenza a base di tallio (Tl +) flusso assay della funzione Kir canale per screening ad alto rendimento composto 7,8,9,10. Il saggio è basato sulla permeabilità del poro K + canale al K + congenere Tl +. A disponibile in commercio fluorescente Tl + colorante reporter viene utilizzato per rilevare il flusso transmembrana di Tl + attraverso il poro. Ci sono almeno tre coloranti disponibili in commercio che sono adatti per TL + saggi flusso: BTC, FluoZin-2, 7,8 e FluxOR. Questo protocollo descrive lo sviluppo dosaggio con FluoZin-2. Anche se originariamente sviluppati e commercializzati come un indicatore di zinco, FluoZin-2 presenta un incremento robusto e dose-dipendente in emissione di fluorescenza su Tl + vincolante. Abbiamo iniziato a lavorare con FluoZin-2 prima FluxOR era disponibile 7,8 e hanno continuato a farlo 9,10. Tuttavia, le fasi di sviluppo del test sono sostanzialmente identiche per tutti e tre i coloranti, e gli utenti devono determinare quale colorante è più adatto per la loro specifica nresponsabili politici. Discutiamo anche benchmark delle prestazioni del saggio che devono essere raggiunti da considerare per l&#39;ingresso al MLPCN. Poiché Tl + permea facilmente la maggior parte dei canali del K +, il test deve essere adattabile alla maggior parte dei canali K + obiettivi.

L&#39;uso di una tetraciclina inducibile sistema di espressione fornisce un comodo controllo interno per distinguere Tl + flusso attraverso percorsi endogeni e il canale Kir di interesse. Figura 1 mostra alcuni esempi di mappe di placcatura cellulari utilizzate in diversi tipi di esperimenti. Le posizioni dei pozzetti contenenti cellule uninduced o tetraciclina indotta sono indicati con colori diversi. Figura 2A mostra la mappa piastra sorgente utilizzato per determinare la c...

Metodi per lo sviluppo e la convalida di un metodo quantitativo di fluorescenza per misurare l&#39;attività di potassio raddrizzatore attivo (Kir) canali di screening ad alto rendimento composto è presentato.

High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

Alcuni membri specifici della famiglia dei canali potassio a rettificazione entrante (Kir) sono ipotizzati come bersagli farmacologici per una serie di disturbi, tra cui l'ipertensione, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è scoprire nuovi composti che modulano l'attività dei canali del potassio rettificatori entranti. Questo viene raggiunto innanzitutto seminando cellule HK 2 9 3, inducibili con tetraciclina e che esprimono un canale KIR di interesse, in una piastra da 384 pozzetti. Il secondo passaggio consiste nel caricare le cellule con un colorante fluorescente marcatore del tallio denominato flu in two.Successivamente, il colorante non incorporato viene rimosso dalle cellule mediante lavaggio e sostituito con un buffer di saggio contenente un veicolo controllo o composti in prova. L'ultimo passaggio consiste nell'aggiunta di un buffer stimolante alle pozzette per avviare il flusso di tallio. Infine, un lettore di piastre a fluorescenza viene utilizzato per identificare i composti che modificano il movimento degli ioni tallio attraverso il canale KIR.Scadente.Il principale vantaggio di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti, come l'elettrofisiologia con patch clamp manuale, è che consente all'investigatore di eseguire centinaia di esperimenti contemporaneamente e migliaia di esperimenti al giorno. Questo metodo permette all'investigatore di esamin

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A real-time procedura di screening per identificare i farmaci che interagiscono con la proteina G-gated verso l'interno raddrizzatore...

Un test di screening a fluorescenza per l&#39;identificazione di modulatori Canali GIRK

Tecniche biosensore ottico in grado di rilevare variazioni nella massa in prossimità della membrana plasmatica in cellule viventi e consentono di seguire le risposte cellulari in entrambe singole cellule e popolazioni di cellule. Questo protocollo descrive rilevamento della modulazione dei canali del potassio da G recettori accoppiati alle proteine ​​in cellule intatte utilizzando questo approccio.

L&#39;uso di biosensori ottici privi di etichetta per rilevare modulazione dei canali del potassio da G-recettori accoppiati a proteine

Qui descriviamo un saggio genetico reporter basato su cellule come uno strumento prezioso per lo screening di librerie chimiche per composti che modulano i meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitati attraverso 3' UTR.

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L'interazione tra i canali HCN e la loro subunità accessoria è stato identificato come un obiettivo terapeutico nel Disturbo Depressivo Maggiore. Qui, un metodo di polarizzazione basato fluorescenza per identificare piccole molecole inibitrici di questa interazione proteina-proteina, è presentato.

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Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali

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Studio delle funzioni e delle attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

Questo protocollo descrive un metodo di screening ad alto rendimento basato sulla citometria a flusso per identificare farmaci a piccole molecole che inibiscono l'attivazione dell'integrina β2 sui neutrofili umani.

Una tecnica ad alto rendimento basata sulla citometria a flusso per lo screening di farmaci inibitori delle integrine

Il targeting farmacologico dei canali ionici è un approccio promettente per il trattamento dei tumori solidi. Vengono forniti protocolli dettagliati per caratterizzare la funzione dei canali ionici nelle cellule tumorali e dosare gli effetti dei modulatori dei canali ionici sulla vitalità del cancro.

Screening dei canali ionici nelle cellule tumorali

Scopri un saggio di fluorescenza per misurare l'attività dei canali del potassio Kir e identificare nuovi modulatori tramite screening ad alto rendimento. Questo metodo consente di testare migliaia di composti al giorno.

High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

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