High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di scoprire nuovi composti che modulano l'attività dei canali del potassio raddrizzatori verso l'interno. Ciò si ottiene mediante la prima placcatura di tetraciclina inducibile, HK 2 9 3 cellule, esprimendo un canale KIR di interesse in una piastra a 384 pozzetti. Il secondo passo consiste nel caricare le cellule con un colorante reporter fluorescente al tallio chiamato flu in two.

Successivamente, il colorante non incorporato viene lavato via dalle cellule e sostituito con un tampone di analisi contenente un controllo del veicolo o composti di prova. La fase finale consiste nell'aggiunta di un tampone di stimolo ai pozzetti per avviare il flusso di tallio. In definitiva, un lettore di piastre a fluorescenza viene utilizzato per identificare i composti che modificano il movimento degli ioni tallio attraverso il canale KIR. Povero.

Il vantaggio principale di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti come l'elettrofisiologia manuale del patch clamp è che consente allo sperimentatore di eseguire centinaia di esperimenti contemporaneamente e migliaia di esperimenti al giorno. Questo metodo consente allo sperimentatore di esaminare librerie di migliaia di piccole molecole per scoprire modulatori dei canali del potassio rettificanti verso l'interno Un giorno prima dell'esperimento di flusso di tallio, dissociare le cellule e quantificare la densità della sospensione cellulare come descritto nel manoscritto allegato. Successivamente, utilizzare il terreno BH contenente il 10% di piastra FBS dializzata 20.000 cellule monoclonali trasfettate stabilmente con un gene canale KIR di interesse in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti rivestita di Amin con rivestimento puro BD utilizzando un combo thermo multi goccia o un pipettatore multicanale il giorno successivo, ispezionare la piastra al microscopio per assicurarsi che le cellule siano aderenti e distribuite uniformemente sul fondo dei pozzetti.

Quindi utilizzare una lavatrice per micropiastre ELX 4 0 5 per sostituire il terreno di coltura cellulare con il test HBSS. Tampone a 20 microlitri per pozzetto. Successivamente, preparare le influenze in una soluzione di carico 2:00 AM D centrifugando brevemente la provetta per sciogliere 50 microgrammi di influenze in due polveri in 100 microlitri di DMSO anidro.

Ora aggiungi 50 microlitri di una soluzione onic F1 27 DMSO al 20% in peso per volume al colorante. Mescolarli pipettandoli delicatamente. Quindi aggiungere 150 microlitri di influenze in 2:00 AM onic F1 27 a 35 millilitri di test HBSS, tamponare e mescolare delicatamente.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di tampone di caricamento del colorante a ciascun pozzetto che contiene già 20 microlitri di saggio HBSS. Buffer. Incubare le cellule a temperatura ambiente per circa un'ora mentre le cellule si caricano di colorante. Preparare una piastra di stimolo al tallio sciogliendo appena 0,5 grammi di bicarbonato di sodio in 50 millilitri di cinque tamponi di stimolo al tallio.

Quindi aggiungere 50 microlitri di soluzione a ciascun pozzetto di una piastra in polipropilene a 384 pozzetti Dopo che le celle sono state caricate con l'influenza alle 2:00 del mattino. Lavare la piastra con una lavatrice per micropiastre ELX 4 0 5. Successivamente, aggiungere 20 microlitri o 40 microlitri di test HBSS. Torna a ogni pozzetto e la piastra è ora pronta per gli esperimenti.

Caricare il tallio e le piastre cellulari in un sistema di screening funzionale dei farmaci Hema Matsu o in un lettore di piastre per imaging cinetico equivalente con capacità di erogazione di liquidi integrate e utilizzare filtri appropriati per coloranti a base di fluoresceina come l'influenza o quattro. Successivamente, impostare un protocollo di aggiunta singola per aggiungere 10 microlitri di cinque serie X Thallium ai pozzetti corrispondenti della piastra cellulare contenente 40 microlitri di tampone per saggio HBSS. Quindi registrare la fluorescenza di base a una frequenza di campionamento di un hertz per almeno 10 secondi.

La fluorescenza da pozzetto a pozzetto deve essere uniforme e stabile su tutta la piastra una volta stabilite le condizioni ottimali di placcatura cellulare, lavaggio e carico d. Nel frattempo, utilizzare il pipettatore a 384 canali integrato per aggiungere contemporaneamente il tampone di stimolo al tallio a ciascun pozzetto e continuare la registrazione per almeno due minuti in modo da acquisire la velocità e il picco dell'aumento della fluorescenza indotto dal tallio per l'analisi offline. Nella prossima serie di esperimenti, valutare l'uniformità e la riproducibilità del saggio placcando un inibitore di controllo in ogni altro pozzetto di ogni colonna e fila di una piastra da 384 pozzetti e aggiungere DMSO agli altri pozzetti come controllo del veicolo.

Utilizzare un pipettatore multicanale. Realizzare una piastra composta di DMSO pipettando un inibitore del canale KIR target alla concentrazione precedentemente determinata a 80 microlitri per pozzetto e allo 0,1% di DMSO in una piastra di polipropilene a 384 pozzetti. Questo viene fatto aggiungendo un inibitore noto che inizia nel pozzo A uno e si alterna al pozzo B due e così via fino al pozzo B 24.

Ripetere questa procedura con il DMSO iniziando dal pozzetto, B uno e così via fino al pozzo A 24. Ora carica la cella, il composto e le piastre di stimolo al tallio nel lettore di piastre. Quindi impostare un protocollo a due addizioni per aggiungere 20 microlitri delle due serie di composti a concentrazione X ai pozzetti corrispondenti della piastra cellulare contenente 20 microlitri di tampone per saggio HBSS.

Aggiungere i composti alla piastra cellulare e incubarli per un massimo di 20 minuti a temperatura ambiente. Registrare le influenze di base in due fluorescenze per almeno 10 secondi. Quindi aggiungere 10 microlitri di cinque tamponi di tallio a ciascun pozzetto della piastra cellulare.

Ripetere l'esperimento nei tre giorni successivi per stabilire la riproducibilità dei risultati. Utilizzare il flusso di tallio nel DMSO e nelle cellule trattate con farmaci per calcolare un valore per Z prime. Una misura statistica della variabilità da pozzo a pozzo tra le due popolazioni di pozzi calcola Z primo utilizzando questa formula basata sulle medie e sulle deviazioni standard di P e N dove P è il valore di flusso non inibito e N è il valore di flusso completamente inibito.

Un test con valori di ZPrime maggiori o uguali a 0,5 in tre giorni separati è considerato adatto per lo screening ad alto rendimento. Queste figure sono alcuni esempi delle mappe di placcatura cellulare utilizzate in diversi tipi di esperimenti. Le posizioni dei pozzetti contenenti cellule non indotte o indotte da tetracicline sono indicate in diversi colori.

Questa figura mostra la mappa della piastra di origine utilizzata per determinare la concentrazione ottimale di tallio per lo sviluppo del saggio e lo screening dei composti. Il gradiente di colore rappresenta la triplice serie di diluizioni che vanno dal 100% allo 0,002% di tallio, e qui c'è una mappa rappresentativa dell'intensità della fluorescenza con colori freddi e caldi, che indicano valori di flusso di tallio da bassi ad alti. La mappa di placcatura cellulare mostrata qui con un adattamento di quattro parametri della funzione logistica al tallio CRC viene utilizzata per determinare un valore CEE 80 del 15% di tallio.

Questa figura mostra la mappa della piastra di origine utilizzata per determinare la tolleranza DMSO di un saggio. Le colonne uno e 24 contengono solo il tampone di saggio, mentre il gradiente di colore indica la doppia serie di diluizioni che va dal 10% allo 0,01% di DMSO e qui c'è una mappa rappresentativa dell'intensità della fluorescenza con bassi valori di flusso di tallio indicati con blu più scuro. I valori medi di flusso di tallio registrati dai pozzi contenenti le concentrazioni indicate di DMSO sono riassunti qui.

Ora questa figura mostra la mappa della piastra sorgente utilizzata per stabilire le curve di risposta alla concentrazione per gli inibitori noti di un canale KIR. Ogni composto è indicato con un colore diverso ed è tipicamente placcato come una serie di diluizioni a tre diluizioni. Qui è mostrata una mappa rappresentativa dell'intensità della fluorescenza e questa figura mostra l'inibizione dose-dipendente dell'inibitore del flusso di tallio da parte dell'inibitore dopo il suo sviluppo e ottimizzazione.

Il test del flusso di tallio può essere utilizzato anche per eseguire una varietà di saggi farmacologici di routine. Il saggio del flusso di tallio è stato precedentemente adattato per l'uso con canali del potassio legati e del voltaggio, canali cationici non selettivi e persino trasportatori del potassio. Non dimenticare che lavorare con il tellium può essere estremamente pericoloso e durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come l'uso di guanti e un adeguato smaltimento dei rifiuti.