Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell'uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sviluppare un metodo semplice ed agevole per produrre steroidi tridimensionali uniformi di tumori neuroendocrini e un metodo semplice per processare l'inclusione in HistoGel allo scopo di studiarne l'istologia. Questo risultato si ottiene rivestendo uniformemente piastre a 24 pozzetti con aeros, sui quali vengono seminate cellule umane di tumore neuroendocrino in sospensione monocellulare. La piastra viene quindi incubata durante la notte in un incubatore su un agitatore orbitale a una velocità inferiore a 40 giri al minuto e successivamente trasferita su una mensola stabile all'interno dell'incubatore.

Lo sferoide si formerà entro il terzo o quarto giorno, e la sua crescita e integrità vengono monitorate mediante microscopia a contrasto di fase al fine di studiarne l'istologia. Gli steroidi 3D vengono inclusi in HistoGel riscaldato prima della normale procedura di inclusione in paraffina, ottenendo risultati che mostrano la crescita di tumori neuroendocrini sotto forma di steroidi 3D, basati su immagini acquisite durante la microscopia a contrasto di fase. L'istologia degli steroidi 3D viene analizzata mediante colorazione ematossilina-eosina (H&E) e mediante colorazione immunohistochimica di sezioni di blocchi in paraffina degli steroidi 3D.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo esistente è che è semplice, facile, affidabile ed economicamente vantaggiosa. Questo metodo può facilitare la ricerca nel campo della scoperta di farmaci, aiutando a identificare rapidamente farmaci terapeutici per i pazienti affetti da tumori neuroendocrini. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo avranno inizialmente almeno qualche difficoltà a coltivare steroidi 3D di forma e dimensione uniformi.

La chiave per ottenere questo risultato è assicurarsi che le piastre a 24 pozzetti siano uniformemente ricoperte di agros e che le sospensioni cellulari singole siano ben disperse e accurate. Per analizzare l'istologia degli steroidi 3D, dobbiamo eseguire il trattamento dei parenchimi e la colorazione immunoistochimica. L'inclusione istologica degli steroidi 3D rappresenta il passaggio fondamentale che verrà dimostrato più tardi oggi. Per preparare l'agarosio al 1% da utilizzare per il rivestimento delle piastre a 24 pozzetti, aggiungere un grammo di aeros a 100 millilitri di acqua deionizzata in un contenitore da 250 a 500 millilitri e sterilizzare l'aeros mediante autoclave dopo la preparazione.

Trasferire la bottiglia in un bagno d'acqua a 70 gradi Celsius per circa un'ora. Per consentire al mezzo aeros di raffreddarsi a 70 gradi Celsius, il mezzo aeros deve essere mantenuto sterile in ogni momento. All'interno di una cappa a sicurezza biologica, utilizzare una pipetta ripetitiva per distribuire 200 microlitri di aeros in ciascun pozzetto di 2 piastre da 24.

Piastre a fondo piatto per questo protocollo. Qualsiasi tipo di piastra a fondo piatto a 24 pozzetti è adatto, purché le piastre possano essere osservate al microscopio a contrasto di fase. Ruotare delicatamente l'aeros all'interno del pozzetto per distribuirlo in modo uniforme. Un volume di 200 microlitri di aeros è ottimale per formare una superficie concava che permetta ai sferoidi di assumere forme sferiche costanti.

Dopo circa 10 minuti, le piastre a 24 pozzetti rivestite con aeros sono pronte per essere utilizzate. Le cellule bon one impiegate in questo esperimento sono cellule tumorali neuroendocrine pancreatiche umane, o cellule NET, mantenute in un mezzo D-M-E-M-F 12 con FBS al 10% in una piastra per colture cellulari sterile, in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Quando le cellule bon one in monostrato raggiungono una confluenza del 70-80%, vengono preparate sospensioni cellulari singole all'interno di una cappa a sicurezza biologica.

Rimuovere il mezzo e lavare le cellule due volte con PBS, quindi staccare le cellule dalla piastra aggiungendo un millilitro di tripsina e incubando a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Verificare al microscopio che tutte le cellule siano state distaccate dalla piastra, quindi aggiungere nove millilitri di mezzo di crescita alla tripsina.

Pipettare le cellule degli occhi su e giù alcune volte per assicurare una sospensione uniforme di cellule singole. Utilizzare un filtro cellulare da 70 micron per filtrare le cellule. Dopo aver effettuato il conteggio cellulare, raccogliere le cellule filtrate e preparare una sospensione di 5.000 cellule per millilitro in D-M-E-M-F 12 con mezzo di crescita contenente il 10% di FBS.

Il numero di cellule da seminare deve essere determinato empiricamente in base alle dimensioni delle sferoidi al sesto giorno. Idealmente, si desidera ottenere una dimensione compresa tra 300 e 400 nanometri di diametro. Per questo motivo, seminiamo mille cellule per 200 microlitri per pozzetto.

Per iniziare questa procedura, sovrapporre 200 microlitri della sospensione di cellule singole su ciascun pozzetto rivestito con aero della piastra a 24 pozzetti precedentemente preparata e sigillare la piastra a 24 pozzetti con nastro sterile per prevenire l'evaporazione. Posizionare le piastre a 24 pozzetti rivestite con aero contenenti cellule bon one su un agitatore orbitale con agitazione molto lenta in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica in aria, incubare per tutta la notte; nella mattina seguente, spostare le piastre su una piattaforma stabile e mantenere le colture in crescita all'interno dell'incubatrice. Ogni tre giorni.

Aggiungere 200 microlitri di mezzo di crescita in ogni pozzetto delle piastre. Per evitare di disturbare il phe, appoggiare la punta della pipetta sul lato del pozzetto e lasciare che il mezzo scorra lungo la parete fino a raggiungere il fondo. Monitorare la formazione di OID nelle piastre a 24 pozzetti al microscopio. Il trattamento farmacologico dei steroidi 3D viene iniziato al sesto giorno di coltura.

Quando gli sferoidi raggiungono un diametro compreso tra 300 e 400 micron, questo viene indicato come giorno zero per il trattamento farmacologico al giorno sei. Ogni pozzetto delle piastre contiene circa 400 microlitri di mezzo, in modo da garantire che i trattamenti farmacologici abbiano una concentrazione finale pari a uno x in ogni pozzetto; per ogni dose di trattamento, preparare una soluzione tre volte più concentrata, diluendo la quantità appropriata di soluzione madre del farmaco in cinque millilitri di mezzo di crescita in un tubo conico da 15 millilitri, quantità sufficiente per otto replicati. I PHE in ogni riga delle piastre a 24 pozzetti sono classificati come veicolo e dose 1, 2, 3, 4 e 5. Per ogni dose di trattamento su ciascuna piastra a 24 pozzetti sono previsti quattro replicati.

Di solito, i phe 3D vengono trattati in almeno 2 piastre da 24 pozzetti, ottenendo almeno otto replicati per ciascuna dose del trattamento. Prima di aggiungere il trattamento a ciascun pozzetto, centrifugare le piastre da 24 pozzetti per assicurarsi che tutta la condensa presente sul nastro del coperchio cada nei pozzetti, a causa della caratteristica di galleggiamento del 3D steroid. Il mezzo in ogni pozzetto non viene rimosso dopo la centrifugazione.

Per evitare il disturbo della sfera, aggiungere con attenzione 200 microlitri di ciascuna dose del trattamento nei pozzetti appropriati lungo la parete di ciascuno. Sigillare ermeticamente le piastre a 24 pozzetti con nastro adesivo e incubare le colture in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica in aria. Monitorare le colture steroidal 3D in ciascun punto temporale scelto dopo il trattamento farmacologico mediante microscopio a contrasto di fase.

Un obiettivo 5x è ideale perché le PHE crescono rapidamente oltre il campo di osservazione con un obiettivo 10x. Acquisire immagini dello steroide in ciascuna pozzetta a ogni punto temporale prima dell'aggiunta di HistoGel. Dopo l'inclusione, gli steroide tridimensionali vengono raccolti dalle piastre a 24 pozzetti e fissati in Formalina al 10%.

Posizionare un tubo di HistoGel freddo in un becher riempito con acqua. Riscaldare il becher nel microonde per un minuto o fino a quando il gel non si è completamente liquefatto. Mantenere il tubo nello stesso becher contenente acqua per tutta la durata della procedura.

Utilizzando una pipetta di plastica monouso, trasferire tutto lo steroide in uno stampo criogenico per biopsia. Lasciare riposare lo steroide per un minuto in modo che affondi sul fondo dello stampo criogenico per biopsia.

Cercare di eliminare il liquido dallo stampo criogenico per biopsia utilizzando salviette Kim. Spingere molto delicatamente lo steroide al centro del fondo dello stampo criogenico per biopsia usando uno stuzzicadenti. Successivamente, utilizzare la pipetta di Pasteur per mantenere molto delicatamente lo steroide al centro dello stampo criogenico per biopsia.

Aggiungere uno strato sottile di HistoGel riscaldato nello stampo criogenico per biopsia. Non aggiungere troppo HistoGel. È sufficiente una quantità che stabilizzi i steroidi al centro.

Lasciare l'ormone steroideo in HistoGel a riposo per uno o due minuti a temperatura ambiente o fino a quando l'HistoGel non si è solidificato. Riempire il resto dello stampo criogenico per biopsia con HistoGel riscaldato e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente per circa 10 minuti. Poco prima di rimuovere il blocco di HistoGel degli OIDs dallo stampo criogenico per biopsia.

Lasciare lo stampo criogenico sul ghiaccio per un minuto, quindi rimuovere delicatamente il blocco intatto di HistoGel con lo steroide. Avvolgere il blocco in un pezzo di pellicola protettiva e collocarlo in una cassetta per tessuti e biopsie. Conservare la cassetta per tessuti e biopsie in un contenitore con etanolo al 70%.

In seguito, vengono eseguite le procedure di routine di elaborazione dei tessuti per l'inclusione in paraffina quando vengono coltivate su piastre da 24 pozzetti con codice aeros. Diverse linee cellulari di net mostrano morfologie differenti, come mostrato qui. La linea cellulare di net pancreatica umana bond one e la linea celluline di net polmonare umana H 7 27 hanno formato steroidi tridimensionali.

Al contrario, qgp uno. Le cellule della rete pancreatica umana mostrano grandi masse porose simili a grappoli d'uva, che non sono considerate stereoidi. Dopo l'allestimento del legame, una volta seminate le cellule in una piastra da 24 pozzetti rivestita con agros, la formazione stereoidale multicellulare si verifica tipicamente entro il terzo o quarto giorno, e lo stereoide diventa più rotondeggiante entro il sesto giorno.

A causa della limitazione di nutrienti e ossigeno, le cellule nel nucleo denso dello steroide iniziano a morire intorno al giorno 10 e, entro il giorno 17, gli steroidi cominciano a disintegrarsi. A causa delle grandi dimensioni o, in alcuni casi, dell'espulsione del cordone necrotico, lo steroide può crescere fino a raggiungere un diametro di 1000 micrometri.

In questo esperimento, i 3D steroidi al giorno sei sono stati scelti come punto iniziale per il trattamento con l'inibitore dell'istone deacetilasi trikes statin A o TSA. È stato precedentemente riportato che gli inibitori dell'istone deacetilasi esercitano effetti antiproliferativi e proto sulle cellule nervose. Queste immagini mostrano la morfologia dei 3D steroidi all'inizio del trattamento e a 24, 48, 72 e 96 ore successive.

V indica il trattamento con il veicolo, che in questo caso è DMSO. D uno a D cinque rappresentano il trattamento con dosi crescenti di TSA in base alle dimensioni di ciascun individuo. L'OID è stato stimato automaticamente mediante un programma informatico personalizzato sviluppato in MATLAB.

Sono stati misurati almeno otto sfere per ciascuna dose di trattamento con TSA in ogni punto temporale, e i risultati sono riportati in questo grafico rispetto al veicolo. Tutte le dosi di TSA hanno mostrato un certo grado di inibizione della crescita degli OID tridimensionali. A concentrazioni di TSA di 125 nanomolari e 250 nanomolari, la crescita degli steroidi tridimensionali è risultata fortemente soppressa, al fine di comprendere l'istologia dello steroide tridimensionale netto.

Le colorazioni H e E e le colorazioni immunoistochimiche sono state eseguite su steroidi 3D coltivati per 17 giorni. KI 67 è un marcatore per le cellule in proliferazione, mentre la caspasi 3 clivata è un marcatore per le cellule apoptotiche. I risultati indicano che le cellule dello strato esterno dello steroide 3D sono attivamente in proliferazione, mentre le cellule all'interno del nucleo sono per lo più necrotiche o apoptotiche.

Al termine di questa procedura, è possibile eseguire ulteriori saggi, come il saggio Cell Titer Glow, al fine di determinare la vitalità cellulare di questi steroidi 3D. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può essere estesa a piastre a 96 pozzetti per effettuare schermate ad alto rendimento, facilitando così la scoperta di farmaci terapeutici nella ricerca sul cancro.