Name: Generazione Substrato per endonucleasi di CRISPR / Cas Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Impara a generare substrati di RNA per studiare l'attività delle endonucleasi Cas nei sistemi immunitari CRISPR di batteri e archei. Questi metodi facilitano l'analisi biochimica della maturazione dell'RNA.

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Gli autori desiderano ringraziare Jeanette Schermuly per la preparazione di ricombinante T7 RNA polimerasi e Ebelt Norman per l&#39;assistenza nella preparazione di Figura 1. Questo lavoro è stato finanziato con fondi della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) e del Max Planck Society.

1. Generazione di lunga pre-crRNA substrati mediante PCR <ol><li> Disegno primer PCR mirati alle regioni spaziatrici di un cluster CRISPR. Aggiungere l&#39;RNA polimerasi T7 (T7RNAP) sequenza promotore (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) per il primer forward e siti di restrizione per il clonaggio del prodotto di PCR in un vettore di entrambi i primers (es BamHI e Hind III per pUC19, Fig. 2A) . Nota: Il T7RNAP richiede un residuo guanidina per iniziazione della trascrizione. </li><li> Amplifica il vostro pre-crRNA sequenza di interesse da DNA genomico mediante PCR. </li><li> Separare i prodotti di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e gel estrarre la banda desiderata. Digerire il prodotto di PCR con gli enzimi di restrizione per creare estremità coesive (ad es BamHI e HindIII, Fig. 2A). Purificare il prodotto di PCR con un kit di purificazione PCR per eliminare clivaggio sottoprodotti. </li><li> Impostare una reazione di ligazione che contiene DNA ligasi T4, T4 DNA ligasi e tamponeun rapporto molare di 3:1 del prodotto spaccati PCR e il vettore lineare pUC defosforilato con corrispondenti estremità appiccicose. Incubare la miscela a 16 ° C per una notte. Trasforma la miscela di ligazione in cellule di Escherichia coli competenti DH5a di protocolli standard e utilizzare il blu di screening per identificare bianco legatura successo. </li><li> Isolare plasmidi da colonie bianche utilizzando un kit di preparazione di plasmidi. Identificare cloni positivi mediante sequenziamento plasmide. In alternativa, colonia PCR potrebbe essere utilizzata per lo screening. </li></ol> 2. Generazione di pre-intermedio crRNA substrati mediante ricottura di oligonucleotidi di DNA <ol><li> Progettare avanti e indietro oligonucleotidi con il desiderato CRISPR ripetizione / distanziale sequenza. Gli oligonucleotidi contengono la sequenza di un promotore T7 RNAP nonché siti di restrizione BamHI terminali (ad esempio e Hind III per pUC19). Terminate le oligonucleotidi per garantire che forma appiccicoso dopo ricottura estremità (vedi fig. 2B </strong&gt;). </li><li> 5&#39;-fosforilare 1 nmol di ciascun oligonucleotide in una reazione separata 20μl contenente 5 ml di T4 polinucleotide chinasi (PNK), 2 microlitri di tampone di T4 PNK 10x, 2 microlitri ATP (10 mM). Incubare ciascun campione per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Ibridare due oligonucleotidi fosforilati. Combinare 1ml del fosforilata miscela avanti oligo (da 2,2.), 1 ml di miscela fosforilata inversa oligo (da 2,2.), 1 ml di tampone di T4 DNA ligasi 10x in una reazione di 10 microlitri. Incubare i campioni per 5 min a 95 ° C su una piastra riscaldante o in acqua bollente, spegnere la fonte di calore e lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente (~ 2-3 ore). Nota: In questa fase critica, il processo di raffreddamento lento favorisce l&#39;appaiamento dei due oligonucleotidi rispetto alla formazione di strutture all&#39;interno di ogni singolo oligonucleotide. </li><li> Legare 4 microlitri della miscela di ibridazione, 1ml di digerito e defosforilato vettore pUC (0,1 mg /microlitri) con DNA ligasi T4, T4 DNA ligasi tampone 10x e 10 mM ATP in una miscela di ligazione 20 microlitri. Incubare il campione a 16 ° C per una notte. </li><li> Trasformare i plasmidi competenti legato in cellule di Escherichia coli DH5a da protocolli standard e di utilizzare lo screening blu bianco. Plasmidi isolare e identificare cloni positivi mediante digestione (per lo screening per inserti della dimensione desiderata) e successivo sequenziamento plasmide. </li></ol> 3. Generazione di breve Cas RNA substrati tramite sintesi personalizzata oligonucleotidi di RNA Progettazione breve Cas RNA substrati (ad esempio, sequenze ripetute singole, fig. 2C) e utilizzare servizi personalizzati RNA di sintesi di oligonucleotidi. Nota: L&#39;inclusione di un deossiribonucleotide in una posizione specificata di un oligonucleotide RNA (Fig. 2C) può essere utilizzata per individuare il sito di scissione RNA. 4. In vitro T7 RNA polimerasi della trascrizione <ol><li> Isolare plasmidi con il costrutto progettato (da 1.9. O 2.7.) Utilizzando un kit di purificazione plasmide maxiprep. </li><li> Linearizzare il plasmide con l&#39;enzima di restrizione che fende valle del frammento clonato (es. HindIII). Garantire la completa digestione. Nota: Se un divergente 3 definito &#39;terminale del trascritto di RNA è desiderato, il costrutto progettato dovrebbe contenere un sito aggiuntivo restrizione specifica per trascrizione &quot;run-off&quot; a monte della sequenza HindIII. </li><li> Purificare il plasmide linearizzato con fenolo: cloroformio (1:1) estrazione e precipitazione con etanolo. Recuperare gli acidi nucleici dal risospendere pellet in acqua DEPC trattata sterile. </li><li> Impostare un in vitro T7 RNAP scappare miscela di trascrizione che contiene 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 spermidina mm, 4 mm di ogni nucleoside trifosfato (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 ug / ml di digeritoplasmide e 0,1 mg / ml in acqua T7 RNAP trattata DEPC. Incubare per 3 ore a 37 ° C. </li><li> Analizzare i trascritti di RNA ottenuti su una denaturazione urea 8 M gel di poliacrilammide al 12% (Fig. 3A). I trascritti di RNA può essere purificato tramite anionico Mono Q cromatografia a scambio 13 e recuperato per precipitazione in etanolo delle frazioni di RNA e risospensione del pellet in acqua trattata con DEPC sterile. Per uso futuro, memorizzare l&#39;RNA a -80 ° C. </li></ol> 5. Cas6 endonucleasi test <ol><li> Impostare un 20 pl in vitro T7 RNAP scappare miscela di trascrizione (vedi 4.4) che contiene una quantità ridotta di 2 mM ATP ed è integrata da 2,5 microlitri α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Purificare prodotti di reazione mediante estrazione da un gel denaturante gel urea 8 M 12% di poliacrilammide. Visualizza bande mediante autoradiografia. </li><li> Produrre e purificare le proteine ​​ricombinanti desiderate Cas. In questo esempio, CAS6 da Clostridium thermocellum stato purificato tramite precipitazione calore e Ni-NTA cromatografia. </li><li> Impostare una reazione saggio endonucleasi (ad esempio per Clostridium thermocellum Cas6, la miscela di reazione contenente 20 mM di Hepes (KOH pH8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12.000 cpm RNA substrato e 1 pM enzima ed è stato incubato a 37 ° C per 30 min). </li><li> Carico 5 pl di miscela di reazione (+ 10 microlitri tampone contenente RNA carico 95% formammide) su un gel di poliacrilammide urea 8 M 12%. Visualizzare i prodotti di taglio dopo elettroforesi mediante autoradiografia. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Un esempio di RNA substrati per l&#39;analisi dell&#39;attività endonucleasi Cas è mostrata in Figura 3A. Un&#39;aliquota di 5 microlitri di una analitica 100 pl in reazione di trascrizione in vitro sono stati caricati. Notare che l&#39;efficienza della produzione di RNA varia tra diversi costrutti. Alcuni fattori di tcappello sono stati osservati per influenzare la quantità di RNA ottenuti sono (i) la sequenza iniziale dopo il 1 G richiesto per l&#39;inizio della trascrizione, (ii) la possibilità di formazione di RNA struttura durante la trascrizione e (iii) la scelta del sito di restrizione per la generazione del run-off posizione di scissione. L&#39;indagine di attività endonucleasica RNA richiede sia altamente purificata ricombinante proteine ​​Cas (Fig. 3B) e adeguati controlli negativi. Idealmente, questo campione di controllo negativo si differenzia il meno possibile dalla reazione indagato endonucleasi Cas. Ciò può essere ottenuto mediante incubazione del RNA con tampone di reazione e lisato cellulare senza Cas espressione (e seguendo la procedura di purificazione identica). Un controllo ideale negativo è l&#39;aggiunta di un deossiribonucleotide nel sito di clivaggio proposto. In figura 3C, la scissione di un 5 &#39;terminale sequenza di ripetizione etichettata viene mostrato per Clostridium thermocellum Cas6. Sotto<html> condizioni identiche, questa ripetizione non è un substrato più quando un deossiribonucleotide è introdotto nella posizione -9. Questo metodo fornisce anche informazioni sul sito di taglio. Infine, una lunga internamente pre-etichettato crRNA è tagliata da Cas6 e due frammenti di scissione sono osservati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di CRISPR / Cas attività. La rassegna segue l&#39;inserimento di una sequenza di DNA virale (protospacer) nel cluster CRISPR (adattamento), la trascrizione e la lavorazione della matrice CRISPR in crRNAs piccoli da una endonucleasi Cas6, l&#39;assorbimento di crRNAs nel complesso Cascade e l&#39;interferenza di un ripetuto attacco virale basato sulla complementarità tra crRNA e protospacer. Motivi Protospacer adiacenti (PAM) sequenze protospacer marchio virali. igura 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Generazione di RNA substrati per proteine ​​Cas. Lo schema mostra il flusso di lavoro per la generazione di (A) a lungo pre-crRNA substrati, (B) intermedio pre-crRNA substrati e (C) breve Cas RNA substrati per la pre-produzione crRNA. Sequenze di esempio sono presentati per la matrice CRISPR di Clostridium thermocellum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Figura 3. Cas6 dosaggio endonucleasi. A.) toluidina poliacrilammide gel blu macchiato di una custom-designed oligonucleotide RNA (250 pmol) e due in vitro di RNA trascritti (5 pl di una tipica reazione di 100 pl). B.) SDS-PAGE gel di un preparato Cas6 (80 pmol) da Clostridium thermocellum dopo caloreprecipitazione a 50 ° C per 1 ora e Ni-NTA cromatografia. C.) il rilevamento di endonucleolitico Cas6 attività per 5 &#39;terminale sequenze ripetute in etichetta e alle pre-crRNA trascritti in vitro. L&#39;introduzione di un dNTP in posizione -9 abolisce Cas6 clivaggio per un breve Cas RNA substrato (S, fig. 2C). A 5 &#39;terminale 8 tag nt è generata anche per la maturazione crRNA da tempo pre-crRNA substrati (L, fig. 2A). Le bande sono stati separati su un gel denaturante 8 M urea poliacrilammide al 12% e visualizzati mediante autoradiografia.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I metodi presentati consentono la generazione di Cas substrati endonucleasi di forcelle di dimensioni diverse e con vari libertà nel design sequenza. L&#39;approccio più straight-forward per la generazione di oligonucleotidi sintetici substrati di RNA è limitata a brevi disegni RNA causa dei costi crescenti e limitazioni tecniche nella creazione di più oligomeri RNA. Mentre riuscita sintesi di RNA è stato riportato per non modificati oligomeri RNA lunghezza di oltre 100 nucleotidi, la massima pratica ed economica per sintesi su RNA giace sotto 40 nucleotidi. Tuttavia, ogni data sequenza può essere sintetizzato e l&#39;introduzione mirata di nucleotidi modificati (ad es desossiribonucleotidi) può essere utilizzata per analizzare siti di taglio in dettaglio. Più pre-cRNA deve essere generato tramite trascrizione in vitro. La ricottura di oligonucleotidi che contengono un promotore T7 RNA polimerasi permette la produzione di lunghezza intermedia pre-CRRNCome. La lunghezza massima di routine ed economicamente oligonucleotidi di DNA sintetizzato è appena sopra 150 nucleotidi e rappresenta il massimo di sintesi pre-crRNAs tramite questo metodo. L&#39;assemblaggio di diverse coppie di DNA ricotti oligonucleotidiche che formano estremità appiccicose con l&#39;altro può estendere questa lunghezza massima ma richiede crescenti sfide nella clonazione del costrutto. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di generare pre-crRNA costrutti (e quindi Cas endonucleasi substrati) con qualsiasi sequenza desiderata. Questo consente di testare i disegni crRNA sintetici. Infine, più pre-crRNAs possono essere ottenuti da PCR amplificati di elementi interi CRISPR genomiche o in frazioni. Modifica del modello in vitro trascrizione plasmide può essere introdotto tramite mutagenesi sito-diretta per la generazione di pre-crRNA varianti. Questi costrutti possono essere utilizzati per analizzare il pattern globale cleavage endonucleolitica all&#39;interno di un interopre-crRNA. Il lavoro pionieristico per la produzione di RNA non modificato tramite polimerasi T7 RNA trascrizione in vitro è stata basata su RNA di trasferimento 14 e bromo mosaic virus RNA 15. Il consenso promotore T7 RNA polimerasi è costituito da un dominio di riconoscimento (-17 attraverso -5) e un dominio di iniziazione (-4 attraverso +6) con inizio della trascrizione in una guanosina essenziale +1 16. A valle di posizioni 1 può essere variata che consente la trascrizione di qualsiasi sequenza desiderata RNA. I metodi presentati per generare in vitro deflusso modelli trascrizione consentire sintesi in vitro di completo pre-crRNAs che corrispondono CRISPR regioni genomiche o sintetici pre-crRNA varianti. Le trascrizioni sono generati con un 5&#39;-trifosfato terminale presente a meno che la reazione di trascrizione è innescato con le GMP per ottenere 5 &#39;monofosfato termini 14. Tali termini sono necessarie se le trascrizioni devono essere etichettaticon T4 polinucleotide chinasi e γ-[32 P]-ATP. Attività di scissione Cas6 e Cas6 enzimi simili genera crRNA contenenti 5&#39;-idrossile e 2 &#39;, 3&#39;-ciclici termini fosfato. Questi RNA possono poi essere analizzate per il riconoscimento da parte del complesso Cascade.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Antartico Fosfatasi </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> trifosfati in grado di trascrizione in vitro ultrapuri Nucleotide </td><td> Bioscience Jena </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Cromatografia liquida, 100 ktapurifier </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNA oligonucleotidi </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNA oligonucleotidi </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Purification Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprep Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Maxi Kit plasmide </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> Polinucleotide Kinase T4 </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi </td><td> propria preparazione </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione Mix deossinucleotidi </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini-PROTEAN Tetra elettroforesi sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Tempesta 840 Scanner </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Deposito Phosphorscreen </td><td> Dinamica Molecolare </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion ad alta fedeltà DNA polimerasi </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> utilizzare il buffer GC </td></tr><tr><td> Blu di toluidina </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP </td><td> Hartmann analitica </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

generazione substrato per endonucleasi di crispr / cas sistemi

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

L&#39;interazione di virus e loro ospiti procariotici plasmato l&#39;evoluzione della vita batterica e archaeal. Procarioti sviluppato diverse strategie per evitare gli attacchi virali che includono la modifica restrizione, l&#39;infezione abortiva e CRISPR / Cas sistemi. Questi sistemi immunitarie che si trovano in molti batteri e la maggior parte sono costituiti da Archaea c lustered r egularly i nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) sequenze e un certo numero di C RISPR come sociated (CAS) geni (Fig. 1) 1-3. Gli insiemi differenti di proteine ​​Cas e le ripetizioni definire almeno tre principali tipi divergenti di CRISPR / Cas sistemi 4. Le proteine ​​universali CAS1 e CAS2 sono proposti per essere coinvolti nella assunzione di DNA virale chegenererà un nuovo elemento distanziatore tra due ripetizioni al 5 &#39;terminale di un cluster CRISPR estendentesi 5. L&#39;intero cluster viene trascritto in un precursore-crRNA contenente tutte distanziale e sequenze ripetute e viene successivamente elaborato da un enzima del diverso Cas6 famiglia in piccole crRNAs 6-8. Questi crRNAs consistono nella sequenza spacer fiancheggiato da una 5 &#39;terminale (8 nucleotidi) e 3&#39; terminale tag derivata dalla sequenza di ripetizione 9. Una infezione ripetuta del virus può essere bloccato come il nuovo crRNA sarà diretto da un complesso proteico Cas (Cascade) al DNA virale e identificarlo come tale attraverso la complementarità base 10. Infine, per CRISPR / Cas sistemi di tipo 1, il CAS3 nucleasi distruggerà l&#39;invasore rilevato DNA 11,12. Questi processi definiscono CRISPR / Cas come un sistema immunitario adattativo di procarioti e aperto un affascinante campo di ricerca per lo studio delle proteine ​​coinvolte Cas.La funzione di molte proteine ​​Cas è ancora sfuggente e le cause per la diversità apparente dei CRISPR / Cas sistemi restano da illuminare. Attività potenziali della maggior parte delle proteine ​​Cas sono stati previsti attraverso dettagliate analisi computazionali. Una frazione importante di proteine ​​Cas sono mostrate o proposti per funzionare come endonucleasi 4. Qui, presentiamo metodi per generare crRNAs e precursori-cRNA per lo studio di endoribonucleases Cas. Saggi di endonucleasi diversi richiedono sequenze ripetute sia brevi che possono direttamente essere sintetizzati come oligonucleotidi di RNA o sequenze più crRNA e pre-crRNA che vengono generati tramite in vitro T7 RNA polimerasi ballottaggio trascrizione. Questa metodologia permette l&#39;incorporazione di nucleotidi radioattivi per la generazione di substrati endonucleasi internamente etichettati e la creazione di crRNAs sintetici o mutante. Cas6 attività endonucleasica è utilizzato per maturare pre-crRNAs in crRNAs con 5&#39;-hydroxyl e 2 &#39;, 3&#39;-ciclici termini fosfato.

CRISPR / Cas sistemi mediata immunità adattativa in Batteri e Archaea. Molte proteine ​​Cas si propongono di agire come agiscono sul endoribonucleases crRNA precursori di varia lunghezza. Qui si illustrano tre diversi approcci per la generazione pre-crRNA substrati per l&#39;analisi biochimica di attività endonucleasi Cas.

Generazione Substrato per endonucleasi di CRISPR / Cas Sistemi

L'interazione tra i virus e i loro ospiti procarioti ha plasmato l'evoluzione della vita batterica e archeica. I procarioti hanno sviluppato diverse strategie per...

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è generare substrati di RNA per lo studio delle endonucleasi Cas, che svolgono ruoli cruciali nei sistemi immunitari CRISPR-Cas presenti nei batteri e negli Archaea, al fine di ottenere substrati di RNA per le endonucleasi Cas. L'amplificazione mediante PCR di una regione CRISPR specifica può essere utilizzata per ottenere un template di DNA lungo per la produzione di RNA in vitro. Se preferito.Due oligonucleotidi possono essere utilizzati come stampo per generare template più corti per la produzione di RNA substrato. In alternativa, sequenze ripetitive brevi, sintetizzate su misura, possono essere testate in saggi con endonucleasi CAS. Infine, la produzione di trascritti di RNA e il successivo taglio da parte dell'endonucleasi CAS6 possono essere visualizzati mediante autoradiografia.Lo scopo principale delle tecniche presentate è consentire ai ricercatori di studiare l'elaborazione dell'RNA CRISPR utilizzando substrati a base di RNA di lunghezza variabile. Pertanto, vengono impiegati diversi metodi per generare piccoli RNA, ad esempio singoli elementi ripetuti oppure RNA più lunghi, come trascritti di tipo crispr, RNA, che comprendono più spacer. Sebbene questi metodi forniscano informazioni specifiche sulla maturazione dell'RNA CRISPR, strategie simili di preparazione dei template possono essere adottate anche per altri sistemi di elaborazione dell'RNA. A dimostrazione della procedura, interverranno Muted Surface, studentessa laureata, e Repl, postdottorando, entrambi di un laboratorio che studia i sistemi immunitari CRISPR nei batteri e negli ArcHa.Una sequenza di DNA virale chiamata protospacer può essere inserita tra due elementi ripetuti in un cluster CRISPR in crescita, in un processo chiamato adattamento. Successivamente, l'intero cluster CRISPR viene trascritto e quindi processato in piccoli RNA CRISPR da una endonucleasi Cas, ad esempio Cas6. I piccoli RNA CRISPR vengono quindi incorporati nel complesso proteico Cas e mediano la difesa dell'ospite contro un attacco virale ripetuto, sfruttando la complementarità delle basi tra l'RNA CRISPR e il protospacer come segnale per la degradazione del DNA virale, generando substrati di pre-RNA CRISPR di lunghezza elevata.Si inizi progettando i primer PCR, mirando le regioni spacer di un cluster CRISPR aggiungendo la sequenza del promotore della RNA polimerasi T7 al primer diretto. Quindi si aggiungano siti di restrizione a entrambi i primer per clonare il prodotto PCR in un vettore. Si noti che la RNA polimerasi T7 richiede un residuo di guanina I per l'inizio corretto della trascrizione dopo aver amplificato la sequenza di RNA pre-CRISPR di interesse dal DNA genomico mediante PCR.Separare i prodotti della PCR mediante elettroforesi su gel agarosio ed estrarre dal gel la banda desiderata; quindi digerire il prodotto della PCR con enzimi di restrizione per creare estremità compatibili. Successivamente, dopo aver purificato il prodotto della PCR utilizzando un kit di purificazione per PCR, per eliminare eventuali sottoprodotti di scissione, aggiungere T4 DNA Ligasi, il suo tampone specifico e un rapporto molare di tre a uno tra il prodotto della PCR digerito e il vettore plasmidico DFOs4, contenente estremità compatibili. Incubare ora la reazione di ligazione a 16 gradi Celsius per tutta la notte, quindi trasformare la miscela in cellule competenti di *E. coli* DH5α seguendo protocolli standard, utilizzando la selezione bianco-blu per identificare le ligazioni avvenute con successo.Infine, isolare i plasmidi dalle colonie bianche utilizzando un kit di preparazione dei plasmidi e identificare le copie positive mediante sequenziamento del plasmide per generare substrati di RNA pre-CRISPR di dimensioni intermedie. Iniziare progettando oligonucleotidi forward e reverse con la sequenza desiderata degli spaziatori ripetuti CRISPR, simile alle sequenze mostrate qui. Si noti che gli oligonucleotidi contengono la sequenza di un promotore dell'RNA polimerasi T7, nonché siti di restrizione terminali dopo la terminazione degli oligonucleotidi, al fine di garantire la formazione di estremità appiccicose.Dopo aver fatto riposare in posizione inginocchiata, incubare i campioni con la polinucleotide chinasi T4 e il relativo buffer per un'ora a 37 gradi Celsius per eseguire la fosforilazione in posizione 5', aggiungendo un'anomalo di ciascun oligonucleotide. Successivamente, incubare gli oligonucleotidi forward e reverse fosforilati con il buffer della DNA ligasi T4 per cinque minuti a 95 gradi Celsius su un blocco riscaldante. Dopo che i campioni hanno ibridato, spegnere la sorgente di calore e lasciare raffreddare la miscela per circa due o tre ore fino a raggiungere la temperatura ambiente.Ora legare gli oligonucleotidi amplificati con una miscela di ibridazione, il vettore P digerito e desfosforilato T quattro, buffer della DNA Ligasi e una TP a 16 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, trasformare i plasmidi legati in cellule competenti di e coli, ceppo DH cinque alfa, mediante protocolli standard utilizzando la selezione bianco-blu per identificare la legatura avvenuta con successo. Infine, isolare i plasmidi e identificare le clone positive mediante digestione e successivo sequenziamento del plasmide.È possibile progettare sequenze di substrato di RNA per cas con ripetizione singola breve simili a quelle mostrate qui. Assicurarsi di includere un desossiribonucleotide. Se si volesse determinare il sito di scissione dell'RNA, si potrebbe ricorrere a un servizio di sintesi su misura per realizzare l'oligonucleotide di RNA.Dopo aver isolato i plasmidi con il substrato personalizzato scelto, utilizzando un kit di purificazione di plasmidi di tipo maxi prep, linearizzare i plasmidi con l'enzima di restrizione che taglia a valle dei frammenti clonati. Successivamente, dopo aver verificato un'esaustiva digestione, purificare il plasmide linearizzato mediante estrazione con fenolo-cloroformio e precipitazione con etanolo. Recuperare gli acidi nucleici mediante risospensione del pellet in acqua sterile trattata con DEPC.Ora incubare i plasmidi digestivi in una miscela appena preparata di trascrizione in vitro con polimerasi T7 in eccesso, contenente ATP, CTP, GTP e UTP, per tre ore a 37 gradi Celsius. Infine, analizzare i trascritti di RNA ottenuti su un gel denaturante di poliacrilammide al 12% contenente otto moli di urea. È inoltre possibile purificare i trascritti mediante cromatografia a scambio anionico con mono Q e recuperare i trascritti precipitandoli con etanolo dalle frazioni di RNA e risospendendo i pellet in acqua sterile trattata con DEPC per analizzare i substrati progettati mediante saggi di endonucleasi, iniziando con la visualizzazione delle bande del substrato mediante autoradiografia e purificando i prodotti della reazione mediante estrazione da gel in presenza di otto moli di urea denaturante.Un gel di poliacrilamide al 12% viene quindi utilizzato per produrre e purificare le proteine CAS ricombinanti desiderate mediante precipitazione termica e una cromatografia su colonna con nickel-NTA, come mostrato per la proteina CAS6 da Clostridium thermocellum. Successivamente, si combina la proteina CAS con una miscela di reazione per endonucleasi appena preparata, lasciando reagire per 30 minuti a 37 gradi Celsius per permettere lo svolgimento del saggio di endonucleasi. Infine, si caricano cinque microlitri della miscela di reazione su un gel in presenza di otto moli di urea.Gel di poliacrilamide al 12% e visualizzazione dei prodotti di scissione dopo elettroforesi mediante autoradiografia. Qui è mostrato un gel di poliacrilamide colorato con blu di Coomassie contenente un oligonucleotide RNA su misura e due trascritti RNA ottenuti in vitro. Si noti che l'efficienza della produzione di RNA varia tra le costruzioni di lunghezza corta, lunga e intermedia.L'analisi dell'attività di endonucleasi dell'RNA richiede controlli positivi e negativi, nonché proteine CAS ricombinanti altamente purificate. In questa figura, un gel SDS-PAGE di una preparazione del campione CAS6 da Clostridium thermocellum.Dopo la precipitazione termica e la cromatografia con nickel-NTA, eseguita in parallelo con un marcatore proteico standard, viene mostrata un'analisi. Un campione di controllo negativo appropriato dovrebbe contenere un lisato cellulare privo dell'espressione di CAS sei, ma sottoposto allo stesso identico procedimento di purificazione di CAS sei; questa preparazione di CAS sei è risultata possedere il livello di purezza richiesto. Qui, il taglio di un substrato di sequenza ripetuta marcato all'estremità cinque primi può essere visualizzato mediante autoradiografia, effettuato dalla proteina CAS sei di Clostridium thermocellum.Ogni corsia contiene il substrato marcato radioattivamente, l'RNA dopo l'incubazione con la proteina ca sei, indicata dai segni positivi, o con un tampone come controllo negativo, indicato dai segni negativi, substrati lunghi o substrati corti con o senza l'aggiunta del deossiribonucleotide. Le posizioni a meno nove sono state utilizzate per facilitare la reazione di endonucleasi. Si noti l'assenza di scissione dei substrati corti quando il deossiribonucleotide è stato incluso nella molecola di RNA seguendo questa procedura.Le nucleasi CAS sei possono essere utilizzate anche come strumento per generare RNA maturi e precisi. Questi RNA possono essere incorporati in complessi a cascata per ottenere informazioni sul loro coinvolgimento nell'interferenza contro attacchi virali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come progettare e produrre substrati CRISPR per Cas e nucleasi.Questi diversi substrati sono utili per affrontare domande relative alla maturazione e all'utilizzo di crispr Es.

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