Generazione Substrato per endonucleasi di CRISPR / Cas Sistemi

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è generare substrati a RNA per lo studio della Cas Endonuclease, enzimi che svolgono ruoli cruciali nei sistemi immunitari CRISPR-Cas presenti nei batteri e negli Archaea, al fine di ottenere substrati a RNA per la Cas Endonuclease. L'amplificazione mediante PCR di una regione CRISPR specifica può essere utilizzata per ottenere un template di DNA lungo da impiegare nella produzione di RNA in vitro. Se preferito.

Due oligonucleotidi possono essere utilizzati per generare modelli più corti per la produzione di RNA substrato. In alternativa, sequenze ripetute sintetizzate su misura e di breve lunghezza possono essere testate in saggi con endonucleasi CAS. Infine, la produzione di trascritti di RNA e il successivo taglio da parte dell'endonucleasi CAS sei possono essere visualizzati mediante autoradiografia.

L'obiettivo principale delle tecniche presentate è consentire ai ricercatori di studiare l'elaborazione dell'RNA CRISPR utilizzando substrati di RNA di lunghezza variabile. Pertanto, vengono impiegati diversi metodi per generare piccoli RNA, ad esempio singoli elementi ripetuti o RNA più lunghi come trascritti di crispr, RNA, che comprendono diversi spacer. Sebbene questi metodi forniscano informazioni specifiche sulla maturazione dell'RNA CRISPR, strategie simili di preparazione dei template possono essere adottate anche per altri sistemi di elaborazione dell'RNA. A illustrare la procedura saranno Muted Surface, una studentessa laureata, e Repl, il postdoc, entrambi di un laboratorio che studia i sistemi immunitari CRISPR nei batteri e negli ArcHa.

Una sequenza di DNA virale chiamata proto-spacer può essere inserita tra due elementi ripetuti in un cluster CRISPR in crescita, in un processo chiamato adattamento. Successivamente, l'intero cluster CRISPR viene trascritto e poi processato in piccoli RNA CRISPR da una endonucleasi Cass, ad esempio CAS sei. I piccoli RNA CRISPR vengono quindi incorporati nel complesso proteico CAS cascade e mediano la difesa dell'ospite contro un attacco virale ripetuto, sfruttando la complementarità delle basi tra l'RNA CRISPR e il proto-spacer come segnale per la degradazione del DNA virale, generando substrati di pre-RNA CRISPR di lunghezza elevata.

Iniziare progettando i primer per PCR, mirando le regioni spacer di un cluster CRISPR aggiungendo la sequenza del promotore dell'RNA polimerasi T7 al primer diretto. Successivamente, aggiungere siti di restrizione a entrambi i primer per clonare il prodotto PCR in un vettore. Si noti che l'RNA polimerasi T7 richiede un residuo di guanina I per l'inizio corretto della trascrizione dopo aver amplificato la sequenza di RNA pre-CRISPR di interesse dal DNA genomico mediante PCR.

Separare i prodotti della PCR mediante elettroforesi su gel agarosio ed estrarre dal gel la banda desiderata, quindi digerire il prodotto della PCR con enzimi di restrizione per creare estremità appiccicose. Successivamente, dopo aver purificato il prodotto della PCR utilizzando un kit di purificazione per PCR, per eliminare eventuali sottoprodotti di scissione, aggiungere il tampone della DNA Ligasi T4, la DNA Ligasi T4 e un rapporto molare da tre a uno del prodotto della PCR tagliato rispetto al vettore plasmidico DFOs four correlato con le corrispondenti estremità appiccicose. Incubare ora la reazione di ligazione a 16 gradi Celsius per tutta la notte, quindi trasformare la miscela in cellule di e. coli competenti, ceppo DH5α, seguendo protocolli standard, utilizzando la selezione bianco-blu per identificare le ligazioni avvenute con successo.

Infine, isolare i plasmidi dalle colonie bianche utilizzando un kit di preparazione dei plasmidi e identificare i cloni positivi mediante sequenziamento del plasmide per generare substrati di RNA pre-CRISPR di dimensioni intermedie. Iniziare progettando oligonucleotidi forward e reverse con la sequenza desiderata degli spaziatori ripetuti CRISPR simile alle sequenze mostrate qui. Si noti che gli oligonucleotidi contengono la sequenza di un promotore dell'RNA polimerasi T7, nonché siti di restrizione terminali dopo la terminazione degli oligonucleotidi, al fine di garantire la formazione di estremità appiccicose.

Dopo aver lasciato in posizione prona, incubare i campioni con la polinucleotide chinasi T4 e il buffer per la polinucleotide chinasi T4 per un'ora a 37 gradi Celsius per eseguire la fosforilazione in posizione 5', un'anomala di ciascuno degli oligonucleotidi. Successivamente, incubare gli oligonucleotidi forward e reverse fosforilati con il buffer per la ligasi T4 del DNA per cinque minuti a 95 gradi Celsius su un blocco termoregolato. Dopo che i campioni hanno ibridato, spegnere la sorgente di calore e lasciare raffreddare la miscela per circa due o tre ore fino a raggiungere la temperatura ambiente.

Ora legare gli oligonucleotidi assemblati con una miscela di ibridazione, il vettore P digerito e deprivato di fosfato T quattro tampone della DNA ligasi e un TP a 16 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, trasformare i plasmidi legati in cellule competenti di e coli, ceppo DH cinque alfa, mediante protocolli standard utilizzando la selezione bianco-blu per identificare la legatura avvenuta con successo. Infine, isolare i plasmidi e identificare le clone positive mediante digestione e successivo sequenziamento del plasmide.

È possibile progettare sequenze di substrato di RNA per cas con ripetizione singola breve simili a quelle mostrate qui. Assicurarsi di includere un desossiribonucleotide. Se fosse necessario determinare il sito di scissione dell'RNA, si potrebbe ricorrere a un servizio di sintesi su misura per realizzare l'oligonucleotide di RNA.

Dopo aver isolato i plasmidi con il substrato personalizzato scelto, utilizzare un kit di purificazione plasmidica tipo maxi prep per linearizzare i plasmidi con l'enzima di restrizione che taglia a valle dei frammenti clonati. Successivamente, dopo aver verificato un'esaustiva digestione, purificare il plasmide linearizzato mediante estrazione con fenolo-cloroformio e precipitazione con etanolo. Recuperare gli acidi nucleici mediante risospensione, sospendendo il pellet in acqua sterile trattata con DEPC.

Ora incubare i plasmidi digestivi in una miscela appena preparata di trascrizione in vitro con polimerasi T7 in eccesso, contenente ATP, CTP, GTP e UTP, per tre ore a 37 gradi Celsius. Infine, analizzare i trascritti di RNA ottenuti su un gel denaturante di poliacrilammide al 12% contenente otto moli di urea. È inoltre possibile purificare i trascritti mediante cromatografia a scambio anionico con mono Q e recuperare i trascritti precipitandoli con etanolo dalle frazioni di RNA e risospendendo i pellet in acqua sterile trattata con DEPC per analizzare i substrati progettati mediante saggi di endonucleasi, iniziando con la visualizzazione delle bande del substrato mediante autoradiografia e purificando i prodotti della reazione mediante estrazione da gel in condizioni denaturanti con otto moli di urea.

Gel di poliacrilamide al 12%, quindi produrre e purificare le proteine ricombinanti Cas desiderate mediante precipitazione termica e cromatografia con nickel NTA, come mostrato per la proteina CAS sei da Clostridium thermocellum. Successivamente, combinare la proteina Cas con un mix di reazione per endonucleasi appena preparato e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius per permettere lo svolgimento della reazione del saggio di endonucleasi. Infine, caricare cinque microlitri del mix di reazione su un gel in urea otto molare.

Gel di poliacrilamide al 12% e visualizzazione dei prodotti di scissione dopo elettroforesi mediante autoradiografia. Qui è mostrato un gel di poliacrilamide colorato con blu di Coomassie di un oligonucleotide RNA progettato su misura e di due trascritti RNA in vitro. Si noti che l'efficienza della produzione di RNA varia tra le costruzioni di lunghezza corta, lunga e intermedia.

Per lo studio dell'attività di endonucleasi dell'RNA sono necessari controlli positivi e negativi, nonché proteine CAS ricombinanti altamente purificate. In questa figura, un gel SDS-PAGE di un campione preparato con CAS6 da Clostridium thermocellum.

Dopo la precipitazione termica e la cromatografia su nichel-NTA eseguita in parallelo a un marcatore proteico standard, viene mostrata un'analisi. Un campione di controllo negativo appropriato dovrebbe contenere un lisato cellulare privo dell'espressione di CAS sei, ma seguendo l'identica procedura di purificazione di CAS sei, la preparazione di CAS sei è risultata possedere il livello richiesto di purezza. Qui, il taglio di un substrato di sequenza ripetuta marcato al terminale cinque prime da parte della proteina CAS sei di Clostridium thermocellum può essere visualizzato mediante autoradiografia.

Ogni corsia contiene il substrato marcato radioattivamente, l'RNA dopo l'incubazione con la proteina ca sei, indicata dai segni positivi, o con un tampone come controllo negativo indicato dai segni negativi, substrati lunghi o substrati corti con o senza l'aggiunta del deossiribonucleotide. Alla posizione meno nove, sono stati utilizzati per facilitare la reazione di endonucleasi. Si noti l'assenza di scissione dei substrati corti quando il deossiribonucleotide era incluso nella molecola di RNA seguendo questa procedura.

Le nucleasi CAS sei possono essere utilizzate anche come strumento per generare RNA maturi e precisi. Questi RNA possono essere incorporati in complessi a cascata per ottenere informazioni sul loro coinvolgimento nell'interferenza contro attacchi virali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e produrre substrati CRISPR per Cas e nucleasi.

Questi diversi substrati sono utili per affrontare domande relative alla maturazione e all'utilizzo delle CRISPR Es.