Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse
25 novembre 2012
Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio mouse.
Il primo passo consiste nell'assemblare il dispositivo a partire da un set per il prelievo di sangue. Tagliare un ago da 25 e tre quarti di calibro da questo tratto di tubo sterile lungo otto centimetri. Utilizzando un connettore a baionetta, è possibile acquistare un ago capillare in vetro con diametro di cento micron oppure realizzarne uno autonomamente con un estrattore per pipette Sutter P 97, quindi aspirare soluzione salina sterile per riempire lo spazio morto all'interno del tubo.
Collegare un tubo capillare di vetro all'estremità del tubo di plastica sterile ed espellere una certa quantità di soluzione salina attraverso l'ago per assicurarsi che sia correttamente fissato e privo di perdite. Osservando al microscopio, verificare la pressione applicata e la velocità di espulsione del liquido attraverso la punta fine; utilizzeremo una soluzione colorata per rappresentare il vettore virale o le cellule staminali. Posizionare il tutto in una piastra di Petri sterile, aspirare una certa quantità di aria e quindi la soluzione per l'iniezione.
Per i nostri scopi, utilizziamo P five topi. In questa immagine, è possibile vedere il muso. La posizione dell'occhio è coperta da una palpebra.
Le linee tratteggiate indicano il margine palpebrale e la piega della palpebra dove verrà effettuata l'incisione. Forbici dritte di tipo Vanis vengono utilizzate per praticare un'incisione di un millimetro e mezzo lungo la palpebra chiusa. Pinze a pressione per fessura vengono impiegate per separare le palpebre ed esporre l'occhio, posizionando il margine palpebrale leggermente dietro al bulbo oculare.
Per eseguire la sclerectomia, è importante saper identificare alcuni punti di riferimento. Il passaggio dalla cornea trasparente alla sclera è delimitato dal limbo. Appena all'interno della sclera si trova l'epitelio pigmentato retinico, poi la retina e quindi il vitreo. L'incisione viene praticata a metà strada all'indietro o all'equatore del bulbo oculare, grattando la superficie con una lama microchirurgica di 15 gradi negli animali fortemente pigmentati.
Un tessuto pigmentato di colore marrone scuro diventerà visibile nel punto dell'incisione. Se l'incisione viene eseguita troppo in profondità, si vedrà fuoriuscire del liquido. Questo rappresenta l'umor vitreo e indica che si è proceduto troppo oltre.
Passaggio della retina RPE. Questa incisione potrebbe essere utilizzata per un'iniezione intravitreale. Ora, l'animale BYO.
L'incisione in questo punto è completa. Ulteriori incisioni e graffi rilasceranno il vitreo per un'iniezione sottoretinica; l'obiettivo è posizionare il capillare in vetro microscopico nello spazio sottoretinico, proprio tra la retina e l'epitelio pigmentato retinico (RPE). Se l'incisione fosse troppo profonda, l'ago potrebbe avanzare oltre la retina entrando nel vitreo. Inserire l'ago parallelamente alla parete esterna dell'occhio.
Per accedere allo spazio sottoretinico, applicare una leggera pressione sullo stantuffo e iniziare a iniettare il liquido. Se l'ago è posizionato correttamente, si percepirà una moderata resistenza e verrà creata una BLE nello spazio sottoretinico.
Se l'ago si trova nel vitreo, la pressione retrostante è notevolmente inferiore. Per evitare un significativo reflusso, mantenere lo stantuffo in posizione per ulteriori 15 secondi prima di rimuovere l'ago. Ciò permetterà alla pressione intraoculare di stabilizzarsi.
Spingere delicatamente l'occhio all'indietro, dietro le palpebre e nell'orbita, utilizzando pinze curve per medicazioni. Ecco un altro esempio di iniezione subretinica in cui il colorante riempie lo spazio subretinico ed è chiaramente visibile in un animale albino. Il menisco d'aria permette di vedere quando si raggiunge la fine dell'iniezione.
Le iniezioni di fluido in un occhio fortemente pigmentato sono leggermente più complesse. L'inserimento accurato dell'ago consentirà di ottenere ottimi risultati.
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Panoramica
Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori per la terapia genica e di cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio del topo. Il processo prevede un'attenta assemblaggio di un dispositivo per la somministrazione precisa degli agenti terapeutici.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Terapia genica
- Ricerca sulle cellule staminali
- Oftalmologia
Sfondo
- La terapia genica mira a trattare o prevenire malattie introducendo materiale genetico nelle cellule.
- Le cellule staminali hanno la capacità di rigenerare tessuti danneggiati.
- Lo spazio subretinico è un'area fondamentale per gli interventi oculari.
- I modelli murini sono comunemente utilizzati per studi preclinici nella ricerca sulla visione.
Scopo dello studio
- Dimostrare una tecnica chirurgica per la somministrazione di vettori per la terapia genica.
- Esplorare il potenziale delle cellule staminali nel trattamento delle malattie retiniche.
- Perfezionare i metodi per iniezioni precise nell'occhio.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio di un dispositivo a partire da un set per il prelievo di sangue.
- Preparazione di un ago in capillare di vetro per l'iniezione.
- Aspirazione di soluzione salina sterile per riempire il dispositivo.
- Utilizzo di una soluzione colorata per rappresentare il vettore virale o le cellule staminali durante la procedura.
Risultati principali
- Il dispositivo consente un'iniezione controllata nello spazio subretinico.
- Visualizzazione con successo dell'espulsione del liquido al microscopio.
- Dimostrazione della fattibilità della tecnica per applicazioni di terapia genica.
- Possibili implicazioni per i futuri trattamenti delle malattie retiniche.
Conclusioni
- Questa tecnica fornisce un metodo affidabile per la somministrazione della terapia genica.
- Sono necessari ulteriori studi per valutare gli esiti a lungo termine.
- Apre nuove strade per trattamenti innovativi nei disturbi retinici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa tecnica chirurgica consente un'accurata somministrazione di vettori per la terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico degli occhi di topi perinatali, supportando la validazione preclinica di terapie oculari. Riducendo al minimo i danni ai tessuti e garantendo un targeting preciso, il metodo migliora la riproducibilità nei flussi di lavoro della scoperta nelle fasi iniziali per i modelli di malattie retiniche. Fornisce una piattaforma scalabile per valutare candidati terapeutici prima di passare a studi su animali di maggiori dimensioni o a ricerche finalizzate all'approvazione clinica (IND-enabling).
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione funzionale di costrutti per la terapia genica in un microambiente oculare rilevante per la malattia.
- Valore operativo: Supporta la validazione del bersaglio confermando il rilascio negli strati cellulari retinici previsti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantificabili della distribuzione di vettori o cellule mediante la formazione di blebs visualizzata nello spazio sottoretinico.
- Valore operativo: Standardizza i parametri di iniezione per una somministrazione riproducibile di composti o cellule tra i diversi gruppi di studio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico consentendo una valutazione longitudinale dell'attecchimento o dell'espressione in modelli perinatali.
- Valore operativo: Permette test di risposta alla dose fondamentali per la caratterizzazione preclinica di sicurezza ed efficacia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica, in particolare per le terapie geniche e cellulari oftalmiche.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi riguardo al tropismo del vettore, all'attività del promotore o all'attecchimento delle cellule staminali nella nicchia retinica.
- Screening: Consente la somministrazione di volumi standardizzati di agenti terapeutici per permettere lo screening comparativo di candidati.
- Analisi: Fornisce letture visive e spaziali (ad esempio, dimensione del bleb, fluorescenza) per quantificare il successo della somministrazione.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta ai studi preclinici mediante la validazione della somministrazione in un modello di occhio neonatale fisiologicamente rilevante.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma chirurgica riutilizzabile per il test iterativo di più vettori o linee cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nell'interazione con il bersaglio confermando la localizzazione subcellulare degli agenti somministrati.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso un assemblaggio standardizzato del dispositivo e una tecnica di iniezione uniforme.
- Valore strategico: Riduce i ritardi nella riduzione del rischio biologico consentendo una validazione funzionale precoce in vivo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione basate su parametri di efficienza di somministrazione e integrità del tessuto.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di microchirurgia e familiarità con l'anatomia oculare neonatale.
- Dipende da strumentazione di precisione, inclusi bisturi microchirurgici, pinze e strumenti per la preparazione di capillari di vetro.
- Necessita di una formazione standardizzata per minimizzare la variabilità nella profondità delle incisioni e nel posizionamento dell'ago tra diversi operatori.
- Deve tenere conto delle difficoltà di visualizzazione dipendenti dalla pigmentazione, quando si adatta a diverse linee di topi.
- È limitato dall'abilità tecnica richiesta per evitare la penetrazione del corpo vitreo e garantire un posizionamento sottoretinico.
