Name: Analisi delle SNARE-mediata fusione della membrana Lutilizzo di un test enzimatico fusione cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Scopri un saggio enzimatico per quantificare la fusione cellulare mediata da SNARE attraverso l'espressione di β-galattosidasi. Questo metodo consente l'analisi di multiple combinazioni di proteine SNARE in modo quantitativo.

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Questo lavoro è sostenuto da fondi di avvio presso l&#39;Università di Louisville e CA135123 dal National Institutes of Health (per CH).

1. Cultura e transfezione cellulare <ol><li> COS-7 cellule vengono coltivate in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 4,5 g / l di glucosio e 10% di siero bovino fetale (FBS). </li><li> Trasfezione plasmide è fatto con Lipofectamine secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen). </li></ol> 2. Analisi al microscopio di fluorescenza Expression SNARE della superficie cellulare <ol><li> Il giorno prima della transfezione, 3 × 10 4 cellule COS-7 sono seminate su sterili 12-millimetri vetrini (Fisher Scientific) contenuti in piastre da 24 pozzetti. </li><li> Per v-celle in ciascun pozzetto, 0,25 microgrammi di plasmide che codifica tTA (pTet-Off, CLONTECH) è co-trasfettate con 0,25 mg di plasmidi che esprimono capovolto vampiri. </li><li> Per le cellule T in ogni pozzetto, 0,25 mg del plasmide codificante TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) è co-trasfettate con 0,25 mg ciascuno dei plasmidi che esprimono capovolte SNAP-25 e sintaxine 1 o 4. </li><li> 24 ore dopo transfection, le cellule vengono fissate con 4% paraformaldeide in PBS + + (PBS supplementato con 0,1 g / l CaCl 2 e 0,1 g / l MgCl 2) per 10 min, e quindi bloccati nel 10% FBS in PBS + + per 30 min. </li><li> Le cellule sono incubate per 1,5 ore con gli anticorpi anti-Myc 9E10 anticorpi monoclonali (neat supernatante di coltura di ibridoma). </li><li> Dopo quattro lavaggi con PBS + +, le cellule vengono incubate per 1 ora con anticorpi secondari coniugati con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories) alla diluizione di 1:500. </li><li> Dopo quattro lavaggi con PBS + +, le cellule marcate sono montati in oro antifade Prolungare reagente (Invitrogen). </li><li> Immagini confocali sono raccolti su un microscopio laser confocale Olympus scansione. Le immagini vengono elaborate con il software Adobe Photoshop. </li></ol> 3. Analisi FACS di espressione SNARE della superficie cellulare <ol><li> Il giorno prima della transfezione, 2 × 10 5 cellule COS-7 sono seminate in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti. </li><li> 24 ore dopo la tradinsfection con la capovolto SNARE, pTet-Off e pBI-G plasmidi, le cellule vengono fissate con 1% paraformaldeide in PBS + + per 15 min, e quindi bloccati nel 10% FBS in PBS + + per 15 min. </li><li> Le cellule sono incubate con gli anticorpi anti-Myc 9E10 anticorpi monoclonali per 60 min. </li><li> Dopo tre lavaggi con PBS + +, le cellule vengono marcate con anticorpi secondari coniugati con FITC (diluizione 1:200) per 45 min. </li><li> Dopo tre lavaggi con PBS + +, le cellule vengono raschiate le piastre con un raschietto cellulare. </li><li> 15.000 cellule vengono analizzate usando un citometro a flusso FACSCalibur (BD Biosciences). L&#39;intensità di fluorescenza media di ciascun campione è ottenuta utilizzando il software CellQuest Pro. </li></ol> 4. Enzimatica cellulare Assay Fusion <ol><li> Il giorno prima della transfezione, 1,2 x 10 6 cellule COS-7 sono seminate in ogni 100 mm piatto di coltura di tessuti, e 2 × 10 5 cellule COS-7 sono seminate in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti. </li><li> Per v-cellule, 0,5 - 5 mg ogni Flipped plasmide VAMP è cotransfected con 5 pg di pTet-Off nelle celle di ogni 100 mm piatto di coltura. Cellule di controllo sono co-trasfettate con il vettore vuoto pcDNA3.1 (+) e pTet-Off. Per impedire la N-glicosilazione di VAMPS 1, 4, 5, 7 e 8, tunicamicina (10 pg / ml) è incluso nel mezzo di coltura cellulare durante la trasfezione. </li><li> Per cellule T in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti, 1 ug di capovolte SNAP-25 e plasmide pBI-G vengono cotrasfettate con 0,5 pg di plasmide o capovolto syntaxin1 0,05 pg di plasmide syntaxin4 capovolte. </li><li> 24 ore dopo la trasfezione, le v-cellule sono staccate da piastre di coltura con l&#39;enzima senza dissociazione cellulare Buffer (Invitrogen). Cellule staccati sono contate con un emocitometro e risospese in tampone HEPES DMEM supplementato con 10% FBS, 6,7 ug / ml e 0,67 tunicamicina mM DTT. </li><li> 4,8 × 10 risospeso 5 V-cellule vengono aggiunti a ciascun pozzetto contenente già le cellule T. </li><li> Ratto dopo 6, 12 o 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2 </sub&gt;, l&#39;espressione di β-galattosidasi è misurata utilizzando il β-galattosidasi Sistema saggio enzimatico con tampone di lisi Reporter secondo le istruzioni del produttore (Promega). Brevemente, le cellule vengono lavate due volte con PBS e lisate in tampone di lisi Reporter. I lisati cellulari sono mescolati con un volume uguale di tampone di saggio 2 ×. Come un controllo in bianco, il tampone di lisi Reporter viene miscelato con il tampone del saggio 2 ×. </li><li> Dopo 90 minuti, la reazione colorimetrica viene bloccata per aggiunta di carbonato di sodio 1 M. </li><li> Assorbanza a 420 nm viene misurata mediante spettrofotometro HITACHI 100-40. </li></ol>

<ol><li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li>
<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs--engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li>
<li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREpins%3A+minimal+machinery+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li>
<li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li>
<li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li>
<li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+%28VAMPs%29+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238(2010).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li>
<li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+%5Bsee+comments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li>
<li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li>
<li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+synaptobrevin%2FVAMP+homologous+protein+%28VAMP5%29+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li>
<li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li>
<li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobrevin%2C+a+novel+synaptobrevin%2FVAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il saggio originale fusione cellulare 6 determina SNARE mediati eventi di fusione cellulare mediante microscopia a fluorescenza. Qui si descrive un saggio innovativo che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule di espressione attiva di β-galattosidasi e la misurazione spettrometrica. Questo test, si analizzano routinariamente 15-20-v e t-SNARE combinazioni in un singolo esperimento. Citometria a flusso per misurare SNARE espressione sulla superficie cellulare, abbiamo titolare i livelli di espres...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente e </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> Cellule COS-7 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T7765-5MG </td></tr><tr><td> pTet-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> PBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamina </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> Enzima soluzione senza dissociazione cellulare </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> Coniglio anti-TET repressore anticorpo policlonale </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC-coniugato asino anti-IgG di topo (H + L) </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> Microscopio a scansione laser confocale </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur citofluorimetro </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> β-galattosidasi Assay sistema enzimatico con il tampone di lisi Reporter </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> Modello 100-40 UV-VIS </td><td> Hitachi </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

analisi delle snare-mediata fusione della membrana l&#39;utilizzo di un test enzimatico fusione cellulare

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Le interazioni di SNARE (s oluble N-ethylmaleimide sensibile al fattore di una proteina recettore ttachment ri) proteine ​​sulla vescicole (v-SNARE) e membrane bersaglio (t-SNARE) catalizzano la fusione della vescicola intracellulare 1-4. Saggi di ricostituzione, sono essenziali per la dissezione del meccanismo e la regolazione di SNARE-mediata fusione della membrana 5. In un saggio di fusione cellulare 6,7, proteine ​​SNARE sono espresse ectopicamente alla superficie cellulare. Questi &quot;girato&quot; SNARE unità proteine ​​fusione cellula-cellula, dimostrando che SNARE sono sufficienti per fondere le membrane cellulari. Poiché il saggio fusione cellulare si basa su analisi microscopica, è meno efficace quando viene utilizzato per analizzare multiple e v-t-SNARE interazioni quantitativamente. Qui si descrive un nuovo saggio 8 che quantifica SNARE-mediati eventi di fusione di cellule dall&#39;espressione attiva di β-galattosidasi. Duecomponenti del sistema Tet-Off genica 9 sono utilizzati come visualizzatore sistema: la tetraciclina controllato transattivatore (tTA) ed un plasmide reporter che codifica il gene lacZ sotto il controllo della tetraciclina-risposta elemento (TRE-LacZ). Abbiamo transfect tTA in cellule COS-7 che esprimono capovolte v-SNARE proteine ​​sulla superficie cellulare (V-cellule) e trasfezione TRE-LacZ in cellule COS-7 che esprimono capovolte t-SNARE proteine ​​sulla superficie cellulare (cellule T) . SNARE-dipendente fusione delle V-e cellule T determina il legame di tTA al TRE, l&#39;attivazione trascrizionale di LacZ e espressione di β-galattosidasi. L&#39;attività di β-galattosidasi è quantificato mediante un metodo colorimetrico mediante assorbimento a 420 nm. Le vescicole associate proteine ​​di membrana (vampiri) sono v-SNARE che risiedono in vari post-Golgi compartimenti vescicolari 10-15. Esprimendo VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 e 8 allo stesso livello, si confronta la fusione della membranaattività che utilizzano il enzimatica fusione cellulare. Basata sulla misura spettrometrica, questo saggio offre un approccio per l&#39;analisi quantitativa SNARE-mediata fusione della membrana e di alta produttività studi.

Per sviluppare un saggio quantitativo fusione cellulare, approfittiamo del forte attivazione trascrizionale dal legame di tTA a TRE. In assenza di tTA, trascrizione del gene LacZ in TRE-LacZ è silenzioso. Quando tTA è presente, si lega al TRE e attiva la trascrizione di LacZ. Figura 1 mostra un diagramma di flusso del saggio enzimatico fusione cellulare. tTA viene transfettato in v cellule che esprimono v-SNARE proteine ​​sulla superficie cellulare, e TRE-LacZ viene t...

Abbiamo sviluppato un saggio fusione cellulare che quantifica SNARE mediati eventi di fusione della membrana mediante espressione di β-attivato galattosidasi.

Analisi delle SNARE-mediata fusione della membrana L&#39;utilizzo di un test enzimatico fusione cellulare

Le interazioni delle proteine SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) presenti sulle vescicole (v-SNARE) e sulle membrane bersaglio...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare gli eventi di fusione cellulare mediati da snare mediante l'espressione attivata di beta galatto. Questo viene ottenuto esprimendo prima in modo ectopico le proteine v- e t-snare sulla superficie delle cellule cost seven. Il passaggio successivo della procedura consiste nel combinare le cellule che esprimono le proteine v-snare con quelle che esprimono le proteine t-snare.Ciò porta alla fusione cellulare mediata da snare e all'espressione attivata di beta galatto. In definitiva, l'attività di beta galatto indotta dalla fusione cellulare viene misurata utilizzando uno spettrofotometro. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio della regione SAL al microscopio, è che può analizzare molteplici combinazioni di snare.Da un punto di vista quantitativo, sebbene questo metodo possa essere applicato per comprendere il meccanismo e la regolazione della fusione delle membrane mediata da snare, può anche essere utilizzato per studi ad alto rendimento. A dimostrare la procedura saranno Doc Na Hassan, un ricercatore postdottorato, e David Humphrey, un tecnico del mio laboratorio, il giorno prima

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Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

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Microscopia confocale per misurare tre modalità di dinamica dei pori di fusione nelle cellule cromaffini surrenali

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