Analisi delle SNARE-mediata fusione della membrana L'utilizzo di un test enzimatico fusione cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare gli eventi di fusione cellulare mediati da snare mediante l'espressione attivata di beta galatto. Questo viene ottenuto esprimendo inizialmente in modo ectopico le proteine v e t snare sulla superficie delle cellule cost sette. Il passaggio successivo della procedura consiste nel combinare le cellule che esprimono le proteine v snare con quelle che esprimono le proteine t snare.

Ciò determina la fusione cellulare mediata da snare e l'espressione attivata del beta-galatto. In definitiva, l'attività del beta-galatto indotta dalla fusione cellulare viene misurata utilizzando uno spettrofotometro. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio della regione SAL al microscopio, è la capacità di analizzare molteplici combinazioni di snare.

Da un punto di vista quantitativo, sebbene questo metodo possa essere applicato per comprendere il meccanismo e la regolazione della fusione delle membrane mediata da snare, può anche essere utilizzato per studi ad alto rendimento. A dimostrare la procedura saranno Doc Na Hassan, un ricercatore postdottorato, e David Humphrey, un tecnico del mio laboratorio, il giorno prima del caricamento della trasfezione.

Piastre a 24 pozzetti con coprislip di vetro da 12 millimetri: preparare due pozzetti per ogni combinazione di cellule esprimenti plasmidi unici nell'esperimento su tali coprislip. Seminare 30.000 cellule COS-7 coltivate in DMEM integrato con 4,5 grammi per litro di glucosio e 10% di FBS da trasfettare. Alle cellule V aggiungere a ciascun pozzetto un quarto di microgrammo del plasmide TTA e un set di plasmidi espressivi.

Proteine invertite di interesse, in questo caso vampiri invertiti, per trasfettare le cellule T aggiungere un quarto di microgrammo del plasmide che codifica per TRE che manca di Z e il set complementare di plasmidi che codificano per le proteine invertite di interesse. In questo caso, SNAP 25, syntaxina 1 e syntaxina 4. Trasfettare ora le cellule cost 7 con lipofezione seguendo le istruzioni del produttore e coltivare le cellule per 24 ore. Dopo 24 ore dalla trasfezione, fissare le cellule in paraformaldeide supplementata per 10 minuti. Al termine della fissazione, risciacquare le cellule tre volte con PBS++, quindi bloccare le cellule con FBS supplementato per 30 minuti.

Dopo il blocco, incubare le cellule con l'anticorpo monoclonale anti mic. Nove E 10 per 30 minuti; dopo quattro lavaggi con PBS più più, incubare le cellule per un'ora con anticorpi secondari marcati con fitzina in un'abbondanza di uno a 500. Dopo altri quattro lavaggi con PBS più più, montare le cellule marcate in un reagente commerciale anti-sfalsamento.

Le cellule sono ora pronte per la microscopia confocale. Il giorno prima della trasfezione, seminare 1,2 milioni di cellule C2C12 in ciascuna piastra da coltura tessutale da 100 millimetri e 200.000 cellule C2C12 in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti per ogni combinazione di plasmidi da analizzare. Preparare una coltura per 24 ore. Il giorno successivo, aggiungere i plasmidi per la trasfezione. Per le cellule V, trasfettare un plasmide che esprime la proteina di interesse in versione invertita e cinque microgrammi di pTet-Off alle cellule in ciascuna piastra da coltura da 100 millimetri.

Trasfetta le cellule di controllo in una piastra da coltura da 100 millimetri con un vettore vuoto e P te off alle stesse concentrazioni relative delle cellule V. Dopo aver aggiunto tutti i plasmidi alle cellule V e alle cellule di controllo, aggiungi tcomicina a quei pozzetti per prevenire la N-glicosilazione dei vamps. In ciascun pozzetto delle piastre a sei pozzetti, co-trasfetta le cellule T con un microgrammo di PBIG insieme ai plasmidi complementari che esprimono le proteine di interesse.

Ora trasfetta le cellule cost seven con lip secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, coltiva le cellule per 24 ore; 24 ore dopo la trasfezione, distacca le cellule V dalle loro piastre di coltura utilizzando un buffer di dissociazione cellulare privo di enzimi. Inizia lavando le cellule una volta con 20 millilitri di PBS.

Quindi aggiungere cinque millilitri di buffer di dissociazione privo di enzimi. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, le cellule si staccheranno battendo bruscamente sulla piastra; verificare al microscopio che si siano distaccate. Se meno della metà delle cellule si è staccata, attendere altri cinque minuti e battere nuovamente sulla piastra.

Continuare l'incubazione nel buffer di distacco fino a quando più della metà delle cellule si sono staccate. Quindi, contare le cellule V con un emocitometro. Successivamente, risospendere le cellule V a una concentrazione di circa 480.000 cellule per millilitro in DMEM integrato con buffer heis.

Ora aggiungere un millilitro di cellule V risospese in ciascun pozzetto contenente le cellule T e reinserire le piastre nell'incubatore. Dopo sei, 12 o 24 ore di co-coltura delle cellule, lavarle con PBS e aggiungere il buffer di lisi. Successivamente, raschiare le cellule dai pozzetti e trasferirle in provette per la centrifugazione.

Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in un nuovo tubo e misurare l'espressione della beta galatto utilizzando un saggio disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore; durante tale protocollo, assicurarsi di arrestare la reazione colometrica dopo 90 minuti aggiungendo carbonato di sodio uno molare per valutare i risultati. Misurare l'assorbanza a 420 nanometri su un spettrofotometro ter. Quando le cellule CO7 sono state trasfettate con plasmidi snare ribaltati, le proteine snare ribaltate sono state espresse sulla superficie cellulare.

La citometria a flusso è stata utilizzata per misurare i livelli di espressione delle proteine snare sulla superficie cellulare. Per confrontare le loro capacità di fusione della membrana, era necessario esprimere le vamp a livello uguale. Pertanto, la concentrazione di ciascun plasmide snare invertito utilizzato nella trasfezione è stata titolata e ottimizzata per la trasfezione.

In tali condizioni, vamp 1, 3, 4, 5, 7 e otto e la sintassina uno e quattro sono stati espressi a livello della superficie cellulare rispettivamente allo stesso livello; i complessi neuronal snare che mediavano l'esocitosi sinaptica sono stati utilizzati per verificare la fattibilità del saggio. In effetti, quando le cellule V che esprimevano vamp due e le cellule T che esprimevano sintassina uno e snap 25 sono state combinate, è stata rilevata una forte espressione di beta-galatto-sidasi. Tuttavia, quando vamp due o snap 25 non erano espressi, è stata rilevata soltanto un'attività basale di beta-galatto-sidasi, indicando che la fusione cellulare e l'espressione della beta-galatto-sidasi dipendono complessivamente dalle interazioni tra snare v e t. In generale, sintassina uno, snap 25, vamp uno, vamp tre e vamp otto hanno mostrato attività di fusione comparabili e le più elevate.

Al contrario, l'attività basale di beta GAL suggerisce che la combinazione di proteine non induce la fusione della membrana, a differenza di quanto avviene tra vamp cinque e SYNTAXIN uno. Snap 25. Durante l'esecuzione del saggio enzimatico di fusione, è importante ricordare di aggiungere la unica micina per prevenire la glicosilazione delle proteine esna e di aggiungere DTT per evitare la formazione di legami disolfuro tra le proteine esna.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il saggio di fusione cellulare.