Name: In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Scopri un metodo di imaging bioluminescente per rilevare infezioni virali del sistema nervoso centrale in modelli murini. Questa tecnica consente di visualizzare in tempo reale l'invasione virale e valutare l'efficacia di vaccini e trattamenti antivirali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Istituto di Scienze Translational UTMB-sovvenzione del NIH 1UL1RR029876-01 e Alisha Prather per il suo aiuto con l&#39;editing video di questo manoscritto.

1. Preparazione degli animali <ol><li> Animal arrivo: All&#39;arrivo al livello animale biosicurezza 2 (ABSL2) servizi, consentire che gli animali un minimo di 2 giorni per acclimatarsi al nuovo ambiente. Dopo questo periodo di riposo, al controllo degli animali per valutare la loro salute e in generale l&#39;aspetto fisico. <ol><li> Quando si utilizza reporter fluorescenti è importante mettere tutti i soggetti animali su una dieta di erba medica libero di limitare la quantità di autofluorescenza GI e segnale di fondo. </li></ol></li><li> Shave animali: Per migliorare il segnale bioluminescente rilevato dal cranio durante l&#39;esposizione; radere le teste di tutti gli animali. Anestetizzare gli animali con una miscela di ossigeno e gas vaporizzato isoflurano. Una volta che gli animali sono completamente anestetizzati, utilizzare tagliatori elettrici a radersi la testa. Una volta finito con rasatura, riportare gli animali nelle loro gabbie e osservare per un completo recupero dagli effetti dell&#39;anestesia. </li><li> Bio Medic datiSystems (BMDS) inserimento transponder (che si terrà dopo la rasatura dei topi, mentre gli animali sono completamente anestetizzati): Per un mezzo meno invasivo per monitorare la temperatura di un impianto pre-programmato BMDS transponder wireless per via sottocutanea nella regione dorsale di ogni topo. Questi transponder permettere di identificare wireless e registrazione della temperatura. Dopo l&#39;impianto del transponder, applicare un veterinario qualità del tessuto adesivo alla ferita. </li><li> Collezione di base: prima infezione, registrare una temperatura basale e il peso per tutti gli animali. Prelevare il sangue per la riduzione della placca prova di neutralizzazione (PRNT) analisi attraverso retro-orbitali (RO) spurgo, mentre i topi sono sotto anestesia. Dopo il prelievo del sangue, applicare pomata antibiotica veterinaria occhio per ridurre il potenziale infezione batterica secondaria. Questa raccolta di base deve essere completato con considerazione il numero di volte che gli animali sono sottoposti in anestesia da stress sui topi. Future collezioni RO should essere completato dopo l&#39;imaging, mentre il mouse è ancora sotto anestesia. Il sangue raccolto da un massimo RO dovrebbe essere di circa 200 pl. </li><li> Infezione: topi posto sotto anestesia come descritto in precedenza. Inoculare per via intranasale utilizzando una dose di 5x10 6 a 5x10 7 pfu TC83-luciferasi in un volume totale di 40 microlitri diluito soluzione tampone fosfato (PBS) attraverso infezione intranasale. A seguito di infezione, posizionare i topi all&#39;interno della loro gabbia di alloggiamento e osservare il recupero. </li></ol> 2. Animal Imaging Disclaimer: Mantenere topi all&#39;interno della loro unità abitativa, l&#39;armadio biosicurezza (BSC), o la scatola di contenimento XIC in ogni momento. Le BSC approvati per questo protocollo sono una classe di tipo II B1 o B2. <ol><li> Iniettare tutti gli animali con 10 ml per grammo di peso corporeo di intraperitoneale (IP) luciferina ad una concentrazione di 15 mg / ml. <ol><li> I topi trattati con Ampligen devono essere injecteIP d alla dose di 12,5 mg / kg di peso corporeo al messaggio infezione -4 ore o 48 ore dopo l&#39;infezione in base al loro gruppo. </li></ol></li><li> Prima dell&#39;iniezione con luciferina, separare i topi in gruppi di tre per garantire un posizionamento adeguato all&#39;interno del XIC-3 scatola di contenimento. <ol><li> Per tutte imaging, utilizzano unguento oculare / lubrificante per impedire l&#39;essiccazione della cornea durante tutta la procedura. </li></ol></li><li> Aprire il software LivingImage e premere Inizializza per preparare la casella di imaging, auto risparmio di serie, tempo di esposizione di auto (tempo di esposizione su auto è una nuova funzione del software LivingImage 3.2 e successivi), vedi campo C, e filtro per aprire; campo di vista si basa sul numero di topi sei imaging; e il filtro può essere ottimizzato come necessario per progetti imaging. </li><li> Verificare che i filtri dell&#39;aria a carbone non è scaduto, il serbatoio è pieno di ossigeno, e il serbatoio viene riempito isoflurano. Mettere piccole strisce di nastro isolante nel XIC-3 icasella di consolazione che aiuta a ridurre il movimento degli animali durante l&#39;esposizione. </li><li> Iniettare i topi con IP luciferina come descritto nella sezione 2.1 e posto all&#39;interno della camera di induzione isoflurano (con coperchio aperto) per 3-5 min. </li><li> Dopo 5 min, chiudere il coperchio della camera di induzione e avviare il flusso di isoflurano. L&#39;anestetico viene utilizzata a circa 3-5% del valore di frequenza di flusso di ossigeno di circa 2,0 L / min. Una volta completamente inconscio attendere un ulteriore 30 sec e trasferire i topi al XIC-3 box di isolamento. Assicurarsi che l&#39;armadio biosicurezza stati utilizzati consente per la sicurezza evacuazione di isoflurano poiché tale procedura comporterà la perdita di isoflurano dalla camera di induzione (l&#39;unità IVIS contiene i propri contenitori passivi Fiera e la XIC-3 scatola di contenimento si collega direttamente alla in / out prese garantire contenute flusso anestetico). <ol><li> Trasferire i topi basate su chip / numero del gruppo nel XIC-3 box di isolamento con il connettore isoflurano allegato und aprire. Posizionare i topi in modo che sono previste in decubito sternale con la testa delicatamente appoggiate sulle strisce di nastro. </li></ol></li><li> Pulire la scatola XIC contenimento con etanolo, le mani a spruzzo e il fondo del XIC-3 con CaviCide, e trasferire alla camera IVIS imaging. Ricollegare l&#39;anestesia alla scatola di contenimento, una volta dentro l&#39;unità di riproduzione. </li><li> Dopo 10 minuti dopo l&#39;iniezione di luciferina, l&#39;immagine dei topi attraverso il software di immagine vivente. </li><li> A seguito di imaging iniziale con un filtro aperto, avviare una DLIT 3-Dimensional immagini utilizzando l&#39;analisi di sequenza guidata di installazione Immagine per bioluminescente luciferasi lucciola. Questo processo di imaging avrà min 4-5 e deve essere eseguita da un campo di vista rilevante per il numero di topi desiderati. <ol><li> Ex-vivo analisi è possibile necroscopia seguente e raccolta del cervello. Mettere il cervello su una piastra di Petri sterile, gocciolamento 50-100 ml di magazzino luciferina sulla parte superiore, e il luogo all&#39;interno del imaging box. </li></ol></li><li> Finalizzare una seconda immagine aperta filtro a 15-17 minuti dopo l&#39;infezione al termine di imaging DLIT. Assicurarsi che l&#39;analisi di sequenza è spento e il campo di vista e impostazioni del filtro Vengono ripristinati i valori precedenti. </li></ol> 3. I topi di ritorno e analisi dei dati <ol><li> Spegnere il vaporizzatore isoflurano e trasferire il recipiente di contenimento XIC torna al mobile biosicurezza. </li><li> Mettere i topi indietro all&#39;interno della loro unità abitativa, chiudere il coperchio superiore, spruzzare l&#39;esterno con un disinfettante appropriato e rimetterlo sul rack custodia. <ol><li> Assicurarsi che i topi hanno pienamente recuperato dall&#39;anestesia. </li></ol></li><li> Ripetere la procedura di cui sopra come l&#39;esperimento è necessario fino a quando l&#39;imaging è stata completata. </li><li> Disinfettare il BSC, spegnere l&#39;apparecchio e trasferire tutti i dati in una posizione laboratorio esterno per ulteriori analisi. </li><li> Analizzare i dati e generare 3 immagini tridimensionali basate su IVIS risultati utinalizzare il software LivingImage. <ol><li> Assicurarsi che l&#39;immagine sia orientato correttamente e illuminazione / bilanciamento del colore è impostato. All&#39;interno della tavolozza degli strumenti le opzioni includono Regolazione immagine, correzioni, informazioni sull&#39;immagine, e Strumenti ROI. </li><li> Utilizzare forme ROI per identificare i punti di forza del segnale specifici basati su posizione. </li><li> Ricostruire la topografia della superficie per evidenziare il corpo del mouse, inizializzare ricostruzione 3D DLIT, e utilizzare in forma lineare per impostare la mappa organo alla ricostruzione topografica. </li></ol></li><li> Ulteriori analisi titolazione virale può essere completato attraverso la raccolta di sangue e di organi. Titolazione in questo studio è stato completato attraverso l&#39;omogeneizzazione del tessuto cerebrale nella modificato aquile medio (MEM). L&#39;omogenato è stato diluito serialmente e abbiamo infettato una piastra ben 6 di cellule Vero per 1 ora. Le cellule sono state coperte con una sovrapposizione agarose/2xMEM 1,5% ed incubate per 2 giorni a 37 gradi. Cellule sono state fissate con formalina al 10% per 30 minuti e trattata concristallo viola. </li></ol>

<ol><li>Steele, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Neurovirulence+and+Tissue+Tropism+of+Wild-type+and+Attenuated+Strains+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Administered+by+Aerosol+in+C3H%2FHeN+and+BALB%2Fc+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology+Online%22%5BJournal%5D)">Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice.</a> Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).</li>
<li>Ludwig, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+neurovirulence+of+attenuated+and+non-attenuated+strains+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).</li>
<li>Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Neuroinvasion+of+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse.</a> Virology. , 208-662 (1995).</li>
<li>Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficient+packaging+of+Venezuelan+equine+encephalitis+virus-specific+RNAs+into+viral+particles+is+determined+by+nsP1-3+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis.</a> Virology. 344, 315-327 (2006).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+non-invasive+imaging+of+alphaviral+brain+infection%3A+Reducing+animal+numbers+and+morbidity+to+identify+efficacy+of+potential+vaccines+and+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals.</a> Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).</li>
<li>Cook, S. H., Griffin, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase+Imaging+of+a+Neurotropic+Viral+Infection+in+Intact+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals.</a> J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nat. Med. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Monkeypox+Viruses+Pathogenesis+in+Mice+by+In+Vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 4, e6592(2009).</li>
<li>Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging+Reveals+Systemic+Dissemination+of+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+in+the+Absence+of+Interferon+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors.</a> J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , (1959).</li>
<li>Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+mouse+model+for+the+evaluation+of+potential+antiviral+compounds%3A+results+with+Venezuelan+equine+encephalomyelitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).</li>
<li>Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pegylated+Alpha+Interferon+Is+an+Effective+Treatment+for+Virulent+Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+and+Has+Profound+Effects+on+the+Host+Immune+Response+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection.</a> J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Anche se questo protocollo riguarda gli aspetti di imaging per l&#39;analisi in vivo, è importante riconoscere il vettore bioluminescente come un fattore chiave per gli studi futuri. L&#39;utilizzazione di TC83, un ceppo di vaccino attenuato VeeV, come vettore per l&#39;espressione della luciferasi assicura che grandi quantità dell&#39;enzima si producono a causa della elevata velocità di replicazione del virus nel SNC come precedentemente descritto 1-4. Mentre l&#39;aggiunta di un secondo promotore ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenogen IVIS System (Spectrum) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XGI-8-gas anestesia sistema </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> XIC-3 Box di contenimento </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LivingImage 4.0 Software </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Telemetria / identificazione chip </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td> IPTT-300 </td><td> Animal ID e Temperature </td></tr><tr><td> BD siringa Integra TB 1 ml con 26 gx &quot;ago 3/8 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305279 </td><td></td></tr><tr><td> Vet legame adesivo del tessuto </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9259532 </td><td></td></tr><tr><td> Vetropolycin oftalmica Pomata </td><td> Webster veterinari </td><td> 78444656 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato Dulbecco Buffered Saline 1X </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> BMDS Chip Reader </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td> DAS-7007S </td><td></td></tr><tr><td> DAS-HOST Software </td><td> Bio Medic Data Systems </td><td></td><td> Consente di scaricare le informazioni della sonda </td></tr></tbody></table>

in vivo imaging systems (ivis) il rilevamento di un neuro-invasiva virus encephalitic

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Progressi moderni in tecnologia di imaging incoraggiare l&#39;ulteriore sviluppo e perfezionamento nel modo in cui si compie la ricerca virale. Inizialmente proposto da Russel e Burch nel 3R Hume (sostituzione, riduzione, perfezionamento), l&#39;utilizzo di modelli animali nella ricerca scientifica è costantemente sotto pressione per individuare nuove metodologie per ridurre l&#39;uso degli animali, migliorando la precisione scientifica e velocità. Una sfida importante per principi di Hume tuttavia, è come garantire gli studi sono statisticamente accurate, riducendo la morbilità della malattia degli animali e numeri complessivi. Studi di efficacia vaccino attualmente richiedono un gran numero di animali per essere considerato statisticamente significativo e spesso comportano elevata morbilità e mortalità endpoint per l&#39;identificazione di protezione immunitaria. Abbiamo utilizzato in vivo imaging sistemi (IVIS) in combinazione con un enzima bioluminescente lucciola per monitorare progressivamente l&#39;invasione del sistema nervoso centrale (CNS) da un mentophalitic virus in un modello murino. Tipicamente, la malattia progredisce in modo relativamente lento, tuttavia replicazione del virus è rapido, soprattutto nel SNC, e può portare ad un spesso, esito letale. A seguito di infezione intranasale dei topi con TC83-Luc, un ceppo attenuato equina venezuelana, virus dell&#39;encefalite modificate per esprimere un gene di luciferasi, siamo in grado di visualizzare la replicazione del virus all&#39;interno del cervello, almeno tre giorni prima della comparsa dei sintomi clinici di malattia. Utilizzando invasione del SNC come endpoint chiave encephalitic sviluppo della malattia, siamo in grado di identificare rapidamente terapeutico e protezione del vaccino contro TC83-Luc infezione prima che i sintomi clinici si sviluppano. Con la tecnologia IVIS siamo in grado di dimostrare il test rapido e preciso di terapie farmacologiche e di vaccini, riducendo il numero degli animali e la morbilità.

Con un virus geneticamente modificato, TC83-luciferasi, abbiamo visto un aumento di potenza del segnale bioluminescente la replicazione del virus si sposta dalla regione nasale nel SNC centrali (Figura 1). A causa dell&#39;elevato tasso di replicazione virale, ci aspettiamo di vedere un alto livello di segnale bioluminescente (Figura 2A) dipendenti dal vettore e la risposta immunitaria degli animali al vettore. Ci aspettiamo che questo aumento del segnale di continuare ad un picco, tra ...

Utilizzando luciferasi e sistemi di imaging in vivo (IVIS) come un nuovo mezzo per identificare terminazioni malattia prima sviluppi clinici verificarsi. IVIS ci ha permesso di visualizzare in tempo reale l&#39;invasione di virus encefalitiche più giorni, fornendo un modello di malattia più accurato per lo studio futuro. E ci ha anche permesso di identificare le caratteristiche potenziali di protezione di antivirali e vaccini più veloce rispetto ai modelli animali attualmente utilizzati. La capacità di utilizzare singoli animali più intervalli di tempo multipli assicura condizioni di polizia, i costi ridotti, e morbilità generale per gli animali utilizzati garantire un mezzo più umane e più scientifico di studio della malattia.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

I moderni progressi nella tecnologia di imaging incoraggiano l'ulteriore sviluppo e il perfezionamento delle modalità con cui viene condotta la ricerca virale. Proposta inizialmente da ...

Oggi presentiamo un metodo per rilevare infezioni del sistema nervoso centrale causate da un alfaviride in specie del genere Aurine, mediante l'uso della tecnologia bioluminescente. Questo metodo impiega TC 83, un ceppo vaccinale attenuato e vivente della encefalite equina venezuelana, nel quale è stato inserito un gene della luciferasi della lucciola, che ci permette di tracciare la replicazione virale durante la diffusione nell'ospite. In un articolo recentemente pubblicato sul vaccino, dimostriamo la nostra capacità di visualizzare l'invio del sistema nervoso centrale e di utilizzarlo come punto terminale dello studio per testare l'efficacia di vaccini e trattamenti antivirali prima che la malattia clinica si manifesti nei nostri gruppi di controllo.Ciao, mi chiamo Allison Ard e sono un tecnologo animale nei laboratori ad alto contenimento dell'Università della Texas Medical Branch. Il lavoro che vedrete in questo video è stato eseguito da me, Michael Patterson, studente laureato qui all'UTMB, e Katie Taylor, una studentessa laureata senior del nostro laboratorio. Tutti i lavori mostrati sono stati realizzati presso il Galveston National Laboratory con l'approvazione completa dell'IACUC, seguendo le normative sulla salute ambientale e sulla sicurezza, utilizzando sistemi di imaging in vivo.L'IVUS ci permette di ridurre il numero di animali necessari nei nostri studi grazie alla capacità di generare immagini su base giornaliera per ciascun animale singolo. Oggi verrà mostrata una panoramica della preparazione dell'animale, inclusa la rasatura della fronte BMDS, il posizionamento del chip, l'infezione intranasale con TC 80 D, l'iniezione intraperitoneale di Lucifer per l'imaging, nonché il manipolamento e il trasferimento dell'animale dall'armadio di contenimento Biocon alla scatola per l'imaging. Dalla scatola per l'imaging, trasferiremo l'animale nell'unità di imaging del calibro, illustreremo il processo reale di imaging, l'imaging bidimensionale e tridimensionale, e il trasferimento degli animali, al termine dell'imaging, nuovamente all'interno dell'armadio a sicurezza biologica.Il nostro laboratorio per animali dispone di una cappa di sicurezza di classe due in cui vengono eseguite tutte le procedure in vitro e in vivo. Accanto alla cappa di sicurezza biologica si trova il Cali ivu spectrum con isofluorano, vaporizzatore e interfaccia computerizzata. Il vaporizzatore di isofluorano consente una somministrazione precisa dell'anestetico inalatorio ed è un metodo più rapido e sicuro per anestetizzare i topi rispetto agli anestetici iniettabili.La cassetta di imaging XI C3 è un'unità sigillata completa di filtrazione HEPA, che ci permette di trasportare in sicurezza gli animali all'interno del laboratorio. In studi precedenti, abbiamo determinato che specie marine con pelaggio più scuro presentano un segnale bioluminescente attenuato direttamente correlato al loro pelo. Raccomandiamo la rasatura della fronte e del muso per migliorare il rilevamento del segnale durante tutto lo studio.Nel corso dei nostri studi, utilizziamo chip transponder BMDS, che ci permettono di raccogliere in modalità wireless informazioni sulla temperatura e sull'identificazione degli animali. Questo metodo di raccolta dati consente di ridurre la manipolazione degli animali e lo stress ad essa associato. Il pelo viene appiattito con una salvietta imbevuta di etanolo e il chip viene inserito per via sottocutanea.Mentre il topo è sotto anestesia, anestetizziamo gli animali per l'infezione intranasale. Una volta incosciente, teniamo delicatamente ciascun animale per la nuca con il muso rivolto verso l'alto.20 microlitri vengono pipettati in ciascuna narice. Per un totale di 40 microlitri per topo, agli animali viene consentito di respirare tra una goccia e l'altra in modo che l'inoculo non si accumuli nella parte posteriore della gola. Per l'iniezione intraperitoneale di luciferina, gli animali vengono delicatamente immobilizzati afferrando la pelle del collo e posizionando la coda sotto il mignolo e l'anulare.Successivamente, la luciferina viene iniettata nell'addome di ciascun animale per garantire una massima diffusione della luciferina nel torrente sanguigno. Attendiamo da cinque a dieci minuti dopo l'iniezione prima di anestetizzare i topi per l'acquisizione delle immagini. Una volta anestetizzati, gli animali possono essere trasferiti nella camera di contenimento per l'acquisizione delle immagini XI C3.I loro capi vengono posizionati delicatamente su strisce di nastro isolante nero, il che riduce lo spostamento cranico. A causa della respirazione, i movimenti interferiranno con il processo di acquisizione delle immagini in tutti i tipi di imaging, inclusi l'imaging tridimensionale, la protrazione completa degli arti e la posizione prona all'interno dell'unità XI C3, che garantisce una mappatura topografica ottimale. Una volta che tutti gli animali sono stati posizionati correttamente, sigillare la scatola XI C3 e pulire l'esterno dell'unità con etanolo, disinfettando le mani prima di rimuovere la scatola dalla cappa a sicurezza biologica.Quando si posiziona il box XI C3 all'interno dell'unità di imaging ivus, assicurarsi che l'anestetico e i contorni siano correttamente collegati ai filtri HEPA fissati al box XI C3. Inoltre, verificare che la griglia di imaging racchiuda completamente i topi prima di chiudere l'unità di imaging e attivare il flusso di anestetico. Una volta aperto il software Living Image, sarà necessario effettuare l'accesso con il proprio nome utente.Quindi si inizializza l'unità ivus. Quando l'unità IVUS è pronta, l'indicatore di temperatura diventa verde, il che avviene intorno ai meno 90 gradi Celsius Ferrari work. Utilizziamo un tempo di esposizione a rilevamento automatico e lasciamo tutte le altre impostazioni sui valori predefiniti.Dopo l'acquisizione dell'immagine, questa apparirà sullo schermo principale. È possibile selezionare regioni di interesse, consentendo di rilevare automaticamente aree specifiche con intensità del segnale elevata. Inoltre, è possibile inserire manualmente le regioni di intensità che si desidera visualizzare, che il sistema non identifica automaticamente nell'imaging tridimensionale.Selezionare un'opzione di configurazione della sequenza, selezionare la procedura guidata di imaging e selezionare bioluminescenza. Una volta selezionata la bioluminescenza, fare clic su DLIT e quindi su Avanti. Nella sezione DLIT, assicurarsi che sia selezionato il reporter corretto per US Firefly e fare clic su Avanti.Assicurarsi che tutte le informazioni siano corrette. Nel nostro caso, l'oggetto dell'immagine è un mouse con un campo visivo di dimensione C. Successivamente facciamo clic su "Avanti" e viene prodotto un set di cinque immagini a lunghezze d'onda variabili, da cinque 60 nanometri a sei 40.Nella nostra prima immagine, abbiamo anche l'immagine topografica acquisita per consentire l'imaging tridimensionale. Quindi facciamo clic su acquisisci sequenza. Una volta acquisite tutte e cinque le immagini, possiamo chiudere la configurazione della sequenza di imaging e iniziare a manipolare la nostra immagine.Per sviluppare una ricostruzione tridimensionale, dobbiamo prima assicurarci di avere una mappa topografica accurata. Impostiamo il nostro soggetto su un topo peloso e su un'orientazione dorsale e lo ricostruiamo. Evidenziamo il topo stesso, evitando di selezionare qualsiasi area di sfondo della scatola.Facciamo clic su avanti e questa sezione potrebbe richiedere del tempo, a seconda dell'immagine e del sistema informatico in uso. Al termine, si otterrà una mappa topografica del corpo del topo. Successivamente si passa alla ricostruzione 3D DLIT.Assicurarsi che le impostazioni della soglia e le proprietà del tessuto siano correttamente configurate. Selezionare avvio e quindi ricostruisci per il nostro o per il cervello. Questo è un altro punto temporale che potrebbe richiedere del tempo in base al sistema di calcolo utilizzato.Al termine, verrà visualizzato un segnale sulla mappa topografica. È quindi necessario fare clic su Strumenti 3D, quindi su Registrazione, Atlante degli organi e, per noi, orientamento dorsale femminile. Possiamo quindi modificare l'opacità degli organi per migliorare la visualizzazione e fare clic su Adattamento lineare per allineare la mappa topografica al set digitale degli organi.È possibile rimuovere tutti gli organi tranne quelli che si desidera effettivamente identificare con il segnale per il cervello US. Utilizzando questa tecnologia, siamo inoltre in grado di creare un video tridimensionale, che consente di ruotare, modificare l'opacità, cambiare la visualizzazione, ingrandire, rimuovere organi e, infine, ridurre lo zoom. Al termine dell'acquisizione delle immagini, spegnere il vaporizzatore di isoflurano e scollegare la scatola di contenimento XI C3.Riportare la scatola sigillata all'interno della cappa a sicurezza biologica e rimuovere delicatamente i topi dal nastro adesivo elettrico. Per durate di imaging più lunghe, all'interno dell'ABS L due, i topi possono essere riscaldati mediante un opportuno manipolamento con guanti.Osserviamo attentamente gli animali per assicurare un completo recupero dall'anestesia. Desideriamo ringraziare il Dott. Pessler e tutti coloro che nel laboratorio hanno contribuito a questo progetto. Desideriamo inoltre ringraziare il Galveston National Laboratory, che ha fornito le strutture e l'equipaggiamento, e l'Institute for Translational Sciences, che ha fornito il finanziamento per questa ricerca.

in-vivo-imaging-systems-ivis-detection-neuro-invasive-encephalitic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Imaging in vivo del transgenico parassiti Leishmania in un host live

Un concomitante infezione da virus dell'influenza A è uno dei fattori implicati nella induzione di malattie invasive da pneumococco durante...

Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

Bioimmagini metodi utilizzati per valutare biodistribuzione delle cellule di nanoparticelle sono applicabili per il monitoraggio terapeutico e diagnostico di composti nanoformulated. I metodi descritti nel presente documento sono sensibili e specifici, quando valutati da coregistrazione istologici. Le metodologie di fornire un percorso traslazionale da roditore a applicazioni sull'uomo.

Bioimmagini registrato di Nanomateriali per il monitoraggio diagnostico e terapeutico

Citomegalovirus (HCMV), l'infezione umana di neonati rappresenta una importante causa di ritardo mentale, ma gli eventi molecolari che portano alla indotta da virus patogenesi sono ancora poco conosciuti. Per indagare le dinamiche di infezione del cervello, abbiamo adattato...

Uso di<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging per monitorare la progressione della Sperimentale mouse infezione da citomegalovirus nei neonati

Questo video illustra un metodo, utilizzando un clinico 3 scanner T, per contrasto-enhanced RM del mouse ingenua proiezione visiva e per studi ripetitivi e longitudinali in vivo di degenerazione del nervo ottico associati a lesioni acute ottico schiacciamento del nervo e la degenerazione del nervo ottico cronica topi knock-out (p50 KO).

In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi

Qui, descriviamo un semplice metodo di iniezione intracerebroventricolare e intravascolare di particelle virali o microsfere fluorescenti nel cervello del topo neonatale. Il modello di localizzazione del virus e delle nanoparticelle potrebbe essere rilevato mediante valutazione microscopica o ibridazione in situ.

Intracerebroventricular e intravascolare Iniezione di Viral particelle e fluorescenti microperle nel cervello neonatale

Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

Nuove tecniche di sgombero dei tessuti immunostaining come l'ultima imaging 3D di organi autorizzati dai solventi consentono la visualizzazione 3D dell'infezione cerebrale da virus del virus della rabbia e del suo complesso ambiente cellulare. Le fette spesse di tessuto cerebrale etichettate con anticorpi sono rese otticamente trasparenti per aumentare la profondità di imaging e consentire l'analisi 3D mediante microscopia a scansione laser confocale.

Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

Presentiamo un nuovo approccio per la microscopia a due fotoni della somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza al glioblastoma in un modello murino.

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

Qui presentiamo una valutazione longitudinale di criceti dorati infettati per via intraperitoneale (IP) o per via intragengivale (IG) con L. infantum-Luc mediante imaging bioluminescente e mediante PCR. I criceti sono stati valutati 1 giorno dopo l'infezione (1 dpi), 1 settimana dopo l'infezione (8 dpi) e 3 settimane dopo l'infezione (22 dpi) e soppressi al 50° dpi e 8 mesi dopo l'infezione.

In vivo Imaging di criceti infetti da Leishmania infantum mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici che esprimono luciferasi

L'imaging con tomografia seriale a due fotoni (STPT) è una tecnica per visualizzare una massa di tessuto nella sua forma tridimensionale combinando l'imaging a due fotoni con il controllo automatico dello stadio e lo slicing del microtomo. Qui descriviamo un protocollo per implementarlo per i cervelli degli uistitì per comprendere meglio le loro caratteristiche strutturali.

Tomografia seriale a due fotoni dell'intero cervello dell'uistitì per analisi neuroanatomiche

Scopri un metodo di imaging bioluminescente per rilevare infezioni virali del sistema nervoso centrale in modelli murini. Questa tecnica consente di visualizzare in tempo reale l'invasione virale e valutare l'efficacia di vaccini e trattamenti antivirali.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

Esplora altri video