L'uso di matrici inverse proteina di fase (RPPA) per esplorare Espressione Variazione proteine ​​all'interno dei singoli tumori a cellule renali

Lo scopo di questa procedura è studiare la variazione dell'espressione proteomica nel carcinoma a cellule renali utilizzando array di proteine in fase inversa o RPPA. Ciò si ottiene mappando e selezionando prima le aree eterogenee dei singoli tumori. Il secondo passo consiste nell'estrarre le proteine dai campioni.

Successivamente, le proteine vengono normalizzate e stampate su vetrini RPPA. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i vetrini utilizzando anticorpi contro le proteine di interesse. In definitiva, l'RPPA viene utilizzato per mostrare la variazione differenziale dell'espressione proteomica in due gruppi di trattamento del carcinoma a cellule renali.

Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune delle domande chiave nel campo del carcinoma a cellule renali. Esiste infatti una grande eterogeneità delle proteine. Le implicazioni di questa tecnica sono che può avere un impatto positivo sul trattamento dei pazienti con carcinoma a cellule renali che vengono trattati con terapie mirate.

Questo perché possiamo studiare l'eterogeneità sia pre che post-trattamento nei campioni di tessuto e quindi, si spera, identificare nuovi bersagli farmacologici per i pazienti che sviluppano resistenza acquisita a questi trattamenti. A dimostrare il criostato e la procedura del ginocchio H sarà la responsabile del laboratorio di ricerca Helen Caldwell, mentre a dimostrare la tecnica di estrazione delle proteine sarà il tecnico di ricerca del nostro gruppo, Jo Nanda. A dimostrare la stampa PPA OR sarà il nostro collega di St.Andrews, Peter Mullen.

Per iniziare questa procedura, rimuovere i tumori dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e conservare con ghiaccio secco. Dividi i tumori in sezioni di circa un centimetro al cubo. Mappare la posizione originale di ciascuna sezione tumorale l'una rispetto all'altra ed etichettarla con un nome univoco.

Rivestire i campioni in OCT e tagliarli in un criostato a meno 22 gradi Celsius dopo che i campioni sono stati colorati. Utilizzando il metodo di colorazione dei contatori hemat, toin e DSN, analizzare le sezioni congelate mediante microscopia. Assicurarsi che le sezioni siano un tumore vitale di carcinoma a cellule renali a cellule chiare e classificarle come di alto grado, di basso grado o misto di basso e alto grado.

Selezionare fino a quattro campioni da ciascuna regione morfologicamente diversa all'interno di ciascun tumore per l'estrazione delle proteine, che verrà dimostrata successivamente per estrarre le proteine dai campioni tumorali. Metti da 50 a 75 milligrammi di fazzoletti. Tagliare da una CT in provette da due millilitri.

Aggiungere 990 microlitri di tampone di lisi, integrato con una proteina in e inibitori della fosfatasi e della proteasi. Aggiungere una singola sfera d'acciaio da cinque millimetri a ciascun tubo e omogeneizzare a 50 hertz per cinque minuti. Utilizzando un laser tissutale.

Controllare il livello di omogeneizzazione e poi omogeneizzare per altri cinque minuti. Utilizzando una pipetta, trasferire il campione omogeneizzato in una nuova provetta da due millilitri, lasciando la sfera d'acciaio dietro una quantità di 10 microlitri di Triton X 100 per ciascun campione, quindi centrifugare a 13.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire i surnatanti S in provette fresche per microcentrifuga e determinare la concentrazione proteica utilizzando il saggio BCA.

Concentrazioni proteiche normalizzate a un milligrammo per millilitro prima della nostra stampa PPA. Da ciascun campione viene effettuata una serie di cinque diluizioni doppie. Uno degli aspetti più dispendiosi in termini di tempo di questa procedura è che il successo di centinaia di diluizioni può essere assicurato mediante un doppio controllo prima della stampa dei vetrini.

Un osservatore robotico a microgriglia viene quindi utilizzato per individuare i lisati proteici su vetrini rivestiti di nitrocellulosa. Ogni campione viene individuato in triplicato, per un totale di 15 punti per campione. I vetrini utilizzati in questo esperimento contenevano due cuscinetti su cui sono stati individuati i campioni.

Ogni pad è stato individuato con campioni identici, in questo caso 100 campioni. Altri formati disponibili includono uno, otto e 16 diapositive. Maggiore è il numero di tamponi, minore è il numero di campioni che possono essere presenti su ciascuno.

Per iniziare la procedura di rilevamento delle proteine, i vetrini bagnati, un tampone bloccante in eccesso e l'incubazione a temperatura ambiente Per un'ora su una piattaforma a dondolo, preparare 800 microlitri di anticorpi primari nel tampone bloccante alle concentrazioni desiderate e conservare in ghiaccio. Dopo un'ora di incubazione. Nel blocco dei vetrini per il montaggio del tampone nella clip per chip a telaio singolo o nel supporto per vetrini a quattro basi a telaio rapido, in modo da formare una tenuta ermetica tra il vetrino e la camera di incubazione.

Rimuovere il tampone residuo dai pozzetti e aggiungere 600 microlitri di anticorpi primari ai rispettivi pozzetti. Posizionare i vetrini e la camera in una scatola umida sigillata e incubare su una piattaforma oscillante per una notte a quattro gradi Celsius la mattina seguente. Rimuovere i vetrini dalla cella frigorifera.

Rimuovere con cautela gli anticorpi primari da ciascuno. Aggiungere 600 micro rilasci di PBS allo 0,1% tra 20 o PBST e lavare i vetrini su una piattaforma oscillante a temperatura ambiente per cinque minuti. In questo modo sostituire il PBST con un nuovo PBST.

Lavare le diapositive per un totale di tre volte. Rimuovere il tampone dai pozzetti e aggiungere 600 microlitri di anticorpi secondari marcati in fluorescenza alla diluizione appropriata ai rispettivi pozzetti. Incubare con anticorpi secondari a temperatura ambiente per 45 minuti agitando delicatamente, è importante proteggere la membrana dalla luce fino al momento della scansione.

Dopo 45 minuti, rimuovere gli anticorpi secondari dai pozzetti e lavare brevemente tre volte in 600 microlitri di PBST a temperatura ambiente. Rimuovere i vetrini dal supporto, trasferirli in un contenitore adatto e lavare in eccesso con PBST per 15 minuti. Mantenere la membrana al buio.

Rimuovere il PBST e lavare la membrana con PBS a temperatura ambiente per 15 minuti per rimuovere nuovamente il tween 20 residuo, mantenendo la membrana al buio. Prova le diapositive veloci in un forno a 50 gradi Celsius per 10 minuti. Infine, scansiona i vetrini a 680 nanometri e/o 800 nanometri a seconda degli anticorpi secondari utilizzati.

Assicurati di tenere le diapositive al buio fino a quando non sono state scansionate. Salva le immagini come file T. Un esempio di vetrino RPPA scansionato può essere visto in questa figura con entrambi i canali a 680 e 800 nanometri mostrati.

La separazione delle immagini in base alla lunghezza d'onda consente di analizzare ogni pad sul vetrino RPPA e di determinare l'espressione proteica individuale, come mostrato qui. L'espressione delle singole proteine nei campioni è unica con la soina in gel che ha un alto livello di espressione attraverso il vetrino rispetto al cmic, che ha un'espressione proteica molto più bassa, ma ancora universalmente espressa in tutti i campioni testati. Al contrario, il CD 10 ha dato un'espressione variabile con alcuni campioni che hanno dato un alto livello di espressione nonostante altri campioni avessero poca o nessuna espressione rilevabile.

Infine, p JK 2 non è riuscito a produrre alcuna espressione proteica rilevabile al di sopra del livello di fondo. La prossima figura evidenzia la mancanza di reattività crociata tra gli anticorpi secondari e gli anticorpi primari di un'altra specie. L'immagine in basso a sinistra mostra il rilevamento dell'espressione proteica utilizzando anticorpi secondari scansionati alla lunghezza d'onda corretta di 680 nanometri.

L'espressione proteica non viene rilevata nell'immagine a destra, scansionata alla lunghezza d'onda errata di 800 nanometri. Di seguito è riportato un esempio della super curva utilizzata per l'analisi comparativa di tutti i campioni sulla diapositiva RPPA. I punti verdi rappresentano i punti accettabili e i punti rossi rappresentano i valori anomali in base ai limiti predefiniti nel software di analisi.

La super curva viene utilizzata per produrre dati di espressione relativi basati sulle proteine. Questa figura mostra i livelli di espressione di una proteina rappresentativa mlh uno in tre vetrini RPPA evidenziando come RPPA possa rilevare differenze tra campioni trattati e non trattati. Ogni campione corrisponde a una sottoregione tumorale.

La figura seguente mostra l'espressione proteica differenziale per mlh 1 dopo che i campioni sono stati raggruppati in base al trattamento. Un'espressione più elevata di MLH 1 è stata riscontrata nel gruppo pre-trattamento quando viene calcolata la varianza intratumorale nell'espressione MLH 1 tra i campioni pre e post-trattamento. Dopo aver raggruppato i campioni in base al trattamento, è stata osservata una varianza più elevata nei campioni post-trattamento.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'o PPA per lo studio dell'eterogeneità delle proteine.