Il Citrobacter rodentium Mouse Model: Studiare Contributi degli agenti patogeni e Host alla colite infettiva

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre la colite infettando i topi con il patogeno specchio gram-negativo, il roditore citrobacter, consentendo lo studio delle interazioni tra patogeno e ospite nel tratto gastrointestinale. Questo si ottiene con la prima inoculazione, una cultura di redenzione zero da un giorno all'altro. Nella seconda fase, i topi vengono infettati mediante sonda orale con l'inoculo notturno.

Successivamente, il settimo giorno dopo l'infezione, il cieco, il colon e il contenuto luminale vengono raccolti durante la fase finale. I tessuti vengono piastrati, le colonie batteriche vengono contate e i tessuti vengono immunocolorati per le proteine dell'ospite di interesse. In definitiva, il carico di patogeni, la funzione di barriera, il danno istologico e i cambiamenti nella risposta dell'ospite possono essere valutati attraverso l'immunoistochimica.

Sebbene questo metodo offra un modello robusto di colite infettiva, consentendo lo studio delle interazioni tra i patogeni dell'ospite e le risposte immunitarie, può anche essere adattato per esaminare gli effetti dell'infezione batterica sul rischio di cancro del colon. Generalmente negli individui nuovi a questo metodo lotterebbe naturalmente con l'infezione batterica dei topi, con o con, o calibro. Inizia utilizzando un circuito di inoculazione sterile per striare il C riscattabile da uno stock di glicerolo congelato su un'elettroplacca LB.

Dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, utilizzare un anello di inoculazione per trasferire le colonie dalla piastra LB a tre millilitri di brodo sterile. Successivamente, incubare la coltura ERO Dunum in modo aerobico in un agitatore di incubazione da banco a 200 RPM durante la notte a 37 gradi Celsius. La mattina dopo, il brodo di libbra inoculato dovrebbe apparire torbido.

Agitare delicatamente la coltura per distribuire uniformemente la coltura cellulare batterica, quindi caricare una siringa da un millilitro con brodo e collegarla a un ago per sonda gastrica. Seleziona un topo per il gavage afferrando saldamente la pelle flaccida sopra il collo e la schiena con fem e dita. Quindi tirare indietro la testa dell'animale con un dito indice per immobilizzare la testa dell'animale e raddrizzare l'esofago per l'inserimento.

Mantenendo il topo in posizione eretta, dirigere la punta del bulbo dell'ago della sonda gastrica lungo il lato della bocca dell'animale e sopra la sua lingua. Passa delicatamente l'ago lungo il tetto della bocca dell'animale e fai avanzare l'ago lungo l'esofago. Infine, utilizzare la siringa per iniettare lentamente 100 microlitri di inoculo batterico, quindi rimuovere delicatamente l'ago della sagoma.

Monitorare la frequenza respiratoria e il comportamento del topo dopo averlo restituito, la sua gabbia il giorno del test, strofinare il topo come appena dimostrato, quindi imbavagliare l'animale con 150 microlitri di destrina fitzy appena preparata. Prelevare il cibo dalla gabbia in questo momento, quattro ore dopo il gavagage, e poi sedazione dell'animale. Utilizzare la puntura cardiaca per raccogliere quanto più sangue possibile dall'animale anestetizzato.

Aggiungere il sangue a una concentrazione finale di destrosio citrato acido al 3% in una provetta da microcentrifuga per scoraggiare la coagulazione. Quindi, centrifugare i campioni di sangue per 12 minuti a 1000 formaggio e quattro gradi Celsius. Quindi raccogliere il siero e portarlo a uno a 10 e da uno a 100 in PBS a 100 microlitri di ciascun campione.

A questi due diluire in una piastra da 96 pozzetti in duplicato. Per preparare la curva standard, diluire 100 campioni da microlitro degli 80 milligrammi originali per millilitro. Fitz Dextrin usato per imbavagliare i topi in PBS in provette da microcentrifuga scure.

Quindi aggiungere i campioni standard a una piastra a 96 pozzetti in triplice copia. Quindi utilizzare un fluorimetro per quantificare la fluorescenza di ciascun campione e per determinare la concentrazione di destrina FXI utilizzando una tecnica asettica, iniziare questo passaggio aggiungendo un millilitro di PBS sterile e una perlina metallica per autoclave al fondo rotondo a due provette da centrifuga da millilitri. Quindi pesare ogni tubo.

Successivamente, dopo aver rimosso il seum e il colon dal topo, separare il seum dal colon e aprirli longitudinalmente. Raccogliere il contenuto luminale con una pinza e aggiungere il contenuto in una provetta di PBS. Lavare il tessuto posteriore e il colon con PBS sterile prima di metterli in provette separate.

Pesare ora le provette di tessuto e omogeneizzare i campioni utilizzando un battitore di microsfere per sei minuti. A 30 hertz, aggiungere 180 microlitri di PBS sterile per pozzetto a una piastra da 96 pozzetti. Quindi aggiungere 20 microlitri di ciascun campione omogeneizzato al primo pozzetto di ogni fila e mescolare bene.

Diluire in serie i campioni aggiungendo 20 microlitri da ciascun pozzetto precedente per ottenere una diluizione da 10 a meno uno nel primo pozzetto fino a 10 a meno sei. Quindi piastra 10 microlitri di ciascuna diluizione da ciascun campione in triplicato su una piastra LB a fondo quadrato con una griglia dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. Conta le unità formanti colonie su un piatto.

Fare la media dei triplicati per ciascun campione, quindi registrare la diluizione alla quale è stato contato ciascun campione. Moltiplicare le CFU medie per 50 e per il fattore di diluizione al quale è stato contato il campione, ottenendo CFU per millilitro. Infine, dividere per il peso del tessuto per determinare le CFU per grammo dopo una notte, formale e fissazione della sezione di colon e secum precedentemente salvata da 0,5 centimetri

La mattina successiva, lavare i fazzoletti con etanolo al 70% e metterli in una cassetta da inviare a una struttura istologica per essere incorporati in paraffina e colorati con ematina ed eosina per deparizzare i tessuti. Mettere i vetrini in un barattolo colorante coplan a bagnomaria a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Ora, posizionare i vetrini nello xilene per quattro lavaggi di due minuti.

Ciascuno reidrata i vetrini con due lavaggi di cinque minuti e etanolo al 100%, seguiti da un lavaggio di cinque minuti in ciascuno dei seguenti: 95% etanolo, 75% etanolo e acqua distillata. Metti i vetrini lavati in un barattolo coplan con tampone di citrato di sodio preriscaldato, quindi metti il barattolo in una vaporiera per 30 minuti dopo aver lasciato riposare il barattolo a temperatura ambiente per altri 30 minuti, lava i vetrini tre volte con PBS Zied per cinque minuti.

Quando i vetrini sono asciutti, segnare l'area intorno al fazzoletto con un pennarello. Quindi bloccare il tessuto con un tampone bloccante in una camera di umidità immunocolorante a temperatura ambiente. Dopo un'ora, versare il tampone bloccante e incubare i tessuti in 50-100 microlitri di anticorpo primario a quattro gradi Celsius durante la notte.

Dopo il periodo di incubazione, lavare i fazzoletti tre volte con PBS Azi per cinque minuti. Quindi incubare i vetrini in 50-100 microlitri di anticorpo secondario al buio a temperatura ambiente dopo un'ora, lavare i vetrini tre volte con acqua distillata per cinque minuti. Infine, disidratare i tessuti, coprire i vetrini con dpi, mezzo di montaggio in oro prolungato, quindi applicare un vetrino coprioggetti per visualizzare i vetrini al microscopio a fluorescenza.

Questa prima figura mostra la destrina di Fitz misurata nel siero di sei topi neri C 57, così come dal recettore toll-like ai topi knockout, che in precedenza erano stati trovati per mostrare una compromissione dell'integrità della barriera epiteliale durante l'infezione in presenza di una barriera epiteliale intestinale intatta. La destrina ZI è scarsamente permeabile attraverso questo strato. Pertanto, l'aumento dei livelli di destrina Fitz nel siero suggerisce una compromissione dell'integrità della barriera epiteliale intestinale durante l'infezione, consentendo a questa molecola di fuoriuscire come livello sierico di controllo nei topi non infetti.

Vengono presentati anche Gavage con destrina Fitz. L'assenso è un patogeno luminale che può aderire intimamente alle cellule epiteliali intestinali. Le cariche batteriche nel contenuto luminale, nel sequel e nei tessuti del colon possono essere al settimo giorno. Post-infezione.

È stato riscontrato che le cariche batteriche nel colon raggiungono un picco compreso tra 10 e la nona CFU per grammo. La maggior parte della patologia osservata durante l'infezione da C DUM nei topi C 57 PL six si verifica macroscopicamente nei due centimetri distali del colon entro il settimo giorno dopo l'infezione. Durante l'infezione si osserva normalmente un ispessimento della mucosa del colon, nonché un accorciamento e una lunghezza del colon

C 57 PL sei topi soffrono solo di infiammazione e patologia moderata caratterizzata istologicamente da infiltrazione di cellule immunitarie, allungamento delle cripte del colon e deplezione delle cellule del coit. Per caratterizzare ulteriormente le risposte dell'ospite durante l'infezione con la colorazione immunofluorescente a riscatto zero può essere utilizzata per esaminare i cambiamenti nelle proteine di interesse, come i marcatori di proliferazione, o per esaminare aspetti della risposta batterica come la sua localizzazione all'interno del tessuto infetto. Un esempio di questa tecnica di colorazione, esaminando la proteina ospite KI 67, un marcatore per la proliferazione cellulare che appare in rosso e la lacrima della proteina zero de, che appare in verde per esaminare la localizzazione batterica al giorno 12 dopo l'infezione, è illustrato in questa figura.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante che la tecnica di misurazione sia eseguita correttamente per garantire che i topi siano infetti e che la salute dell'animale sia monitorata durante tutto il corso dell'infezione. Negli ultimi 10-15 anni, il modello di roditore citrobacter è diventato il gold standard per lo studio dell'attacco di agenti patogeni batterici come l'epec

Inoltre, è diventato un modello ben riconosciuto per lo studio delle risposte immunitarie delle mucose ai batteri, come lo sviluppo delle risposte TH 17 all'interno dell'intestino.