Bioreattore microfluidico picolitro per l'analisi microbica di singole cellule: fabbricazione, configurazione del sistema e funzionamento

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di analizzare singoli batteri e microcolonie isogeniche in evoluzione con piena risoluzione spaziale e temporale in condizioni ambientali costanti utilizzando un dispositivo di coltivazione microfluidica. Ciò si ottiene progettando prima un sistema di coltivazione microfluidica utilizzando un software CAD. Successivamente, i dispositivi di coltivazione microfluidica monouso sono fabbricati in polidimetilsilossano che contengono bioreattori picolitro, un micron e un'altezza per limitare la crescita dei batteri a monostrato.

La coltura microbica viene quindi infusa nel dispositivo microfluidico per inoculare singole cellule madri all'interno dei bioreattori. Queste cellule vengono espanse mediante infusione continua di terreno di crescita attraverso il sistema. I risultati sono ottenuti dalla microscopia time-lapse automatizzata che mostra la coltivazione di un ceppo di Corynebacterium glutamicum rilevante a livello industriale, i dati di crescita e l'eterogeneità cellula-cellula.

Nella biotecnologia convenzionale, la maggior parte delle analisi si basa su dati medi. Il nostro dispositivo microfluidico facilita l'analisi di singole cellule di singoli batteri con risoluzione spaziale e temporale. È uno strumento utile per osservare da vicino l'eterogeneità da cellula a cellula delle microcolonie isogeniche.

Applichiamo la fotolitografia SU-8 comune e lo stampaggio di chip di polidimetilsilossano per produrre dispositivi microfluidici monouso con risoluzione sub micro media. Abbiamo dimostrato con successo la nostra tecnologia con diversi microrganismi biotecnologici come l'Escherichia coli e il Corynebacterium glutamicum. Per iniziare, progetta il dispositivo microfluidico utilizzando il software CAD.

Il progetto presentato in questo protocollo consiste in due ingressi di semina, un generatore di gradiente per la miscelazione di due diversi substrati, un'uscita e sei array costituiti da cinque bio-reattori ciascuno. In una camera bianca, preparare un wafer di silicio da quattro pollici e far girare il codice di un micron di fotoresist SU-8 2000.5 sul wafer come descritto nel protocollo di testo allegato. Posizionare il wafer rivestito su una piastra calda a 95 gradi Celsius per eliminare il solvente in eccesso, quindi inserire la maschera fotografica del primo strato costituita dalle regioni di intrappolamento dei reattori picoliter e dal wafer rivestito all'interno dell'allineatore della maschera.

Quindi, esporre il wafer in modalità contatto sottovuoto a una luce da 350 a 400 nanometri per tre secondi a un'intensità di sette milliwatt per centimetro quadrato. Eseguire una cottura post-esposizione su una piastra calda piana a 95 gradi Celsius per avviare la polimerizzazione di SU-8. Quindi, posizionare il wafer in un bagno di sviluppo SU-8 per un minuto, quindi trasferire il wafer in un secondo contenitore con lo sviluppatore SU-8 fresco per alcuni secondi.

Sciacquare il wafer in isopropanolo per rimuovere lo sviluppatore SU-8 e asciugare il wafer utilizzando un flusso di azoto o una centrifuga per wafer. Quindi, cuocere a fuoco duro la cialda per 10 minuti a 150 gradi Celsius. Quindi, fabbricare il secondo strato come descritto nel protocollo di testo allegato per completare lo stampo master.

Iniziare la fabbricazione del chip PDMS mescolando la base e l'agente di trasporto in un rapporto di 10 a uno. Degassare la miscela PDMS per circa 30 minuti all'interno di un essiccatore sottovuoto fino a quando tutte le bolle sono scomparse. Quindi, posizionare il wafer SU-8 in un dispositivo di stampaggio e versare uno strato di tre millimetri di miscela PDMS sul wafer.

Quindi, cuocere il PDMS per tre ore a 80 gradi Celsius in forno. Una volta raffreddata, staccare con cura la lastra PDMS dal wafer e tagliare la lastra in singoli trucioli utilizzando un bisturi pulito e affilato. Lavare le patatine in un bagno di n-pentano per 90 minuti, seguito da due bagni di lavaggio con acetone per 90 minuti ciascuno.

Asciugare le patatine durante la notte per rimuovere eventuali residui di solvente. Poco prima dell'esperimento, perforare i fori di ingresso e uscita nel chip PDMS utilizzando un ago o un perforatore con un diametro leggermente inferiore rispetto ai connettori utilizzati per collegare i tubi con il chip PDMS. Quindi, pulire accuratamente il chip PDMS microfluidico con isopropanolo e utilizzare lo scotch per rimuovere eventuali particelle di polvere appiccicose.

Inoltre, pulire un vetrino di vetro sottile 170 micron prima con acetone, poi isopropanolo, quindi con acqua deionizzata e asciugare il vetrino con un getto di azoto. Una volta pulito e asciutto, ossidare al plasma il vetrino e il chip PDMS per 25 secondi utilizzando una potenza di 50 Watt e una portata di ossigeno di 20 sccm. Quindi, allineare attentamente il PDMS e il chip di vetro prima di posizionare il PDMS sul vetro, che lo farà legare in pochi secondi.

Fissare l'incollaggio cuocendo il setup per 10 secondi a 80 gradi Celsius. Per preparare i batteri per un esperimento con chip, inoculare una singola colonia di un ceppo batterico desiderato, come C. glutamicum, in 20 millilitri di terreno BHI fresco, e incubare la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius su un agitatore rotante a 120 giri/min. La mattina successiva, trasferire 10 microlitri della coltura starter in una seconda coltura contenente 20 millilitri del terreno desiderato e lasciare che le cellule crescano per una notte nelle stesse condizioni.

Il giorno successivo, preriscaldare l'incubatrice di un microscopio invertito a 30 gradi Celsius. L'operazione può richiedere fino a due ore, a seconda della configurazione individuale. Mentre la configurazione si sta riscaldando, aprire l'incubatrice e selezionare l'obiettivo desiderato e prepararlo con qualsiasi mezzo di montaggio richiesto.

Quindi, montare il chip all'interno del portachip e fissarlo in posizione. Centrare il campione sul microscopio e mettere a fuoco gli array di bioreattori picolitri. Con il chip a fuoco, collegare gli ingressi e le uscite con un tubo appropriato, quindi posizionare il tubo di uscita in un serbatoio di scarico.

Quindi, riempire una siringa con un terreno fresco, inserirla in una pompa a siringa e sciacquare i canali microfluidici per un'ora a una velocità di flusso di 200 nanolitri al minuto per adescare il chip. Mentre le cellule sono ancora nella fase iniziale di crescita esponenziale, trasferire un millilitro di coltura batterica in una siringa sterile e sostituire la siringa e il tubo contenente il terreno con la sospensione cellulare e il tubo nuovo. Infondere la sospensione cellulare nei canali a una portata volumetrica di 200 nanolitri al minuto fino a riempire la maggior parte dei bioreattori picolitri.

Se viene riempito solo un piccolo numero di bioreattori, aumentare la portata da 800 a 1200 nanolitri al minuto. Quando la quantità desiderata di cellule è stata seminata, scollegare la sospensione cellulare, ricollegare il terreno di coltura al chip e perfondere con terreno fresco a 100 nanolitri al minuto. Quindi, scansiona il chip e seleziona bioreattori specifici per l'imaging time-lapse.

Quindi, configurare una sequenza di microscopia time-lapse per visualizzare i bioreattori dall'inizio alla fine e per iniziare l'esperimento. Una volta che tutti i bioreattori picolitri sono cresciuti troppo, interrompi l'esperimento e scarta i chip in modo appropriato. Per iniziare l'analisi, in primo luogo, determinare quali bioreattori soddisfano tutti i criteri desiderati per l'esperimento, come il numero e la posizione delle cellule madri.

Utilizzando un programma di analisi, come l'immagine J, è possibile determinare il tasso di crescita di ciascuna microcolonia contando il numero di cellule in ogni punto temporale. Calcola il tasso di crescita massimo tracciando il tempo rispetto al logaritmo del numero di cellule. Il sistema qui presentato può essere applicato per studiare varie specie batteriche rispetto a diversi parametri biologici come la crescita, la morfologia o un segnale fluorescente.

In questo esempio, C. glutamicum è stato coltivato in condizioni di coltivazione standard e le curve di crescita risultanti derivate da tre microcolonie isogeniche sono mostrate qui. I bioreattori picoliter si sono dimostrati utili anche nell'accesso alla produzione di proteine attraverso l'uso della microscopia a fluorescenza time-lapse, come mostrato qui. Esponendo le cellule a una bassa concentrazione della proteina induttrice IPTG, le variazioni cellula-cellula della proteina possono essere studiate a livello di singola cellula all'interno di colonie a partire da una singola cellula madre.

La tecnica dimostrata può essere applicata per monitorare e analizzare singole cellule batteriche con un perfetto controllo ambientale. Questo è difficilmente possibile con i tradizionali sistemi di coltivazione da banco. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i chip di coltivazione microfluidica per eseguire analisi comparabili di singole cellule.