Generazione di un nuovo vaccino a cellule dendritiche con melanoma e cellule staminali tumorali squamose

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'immunità anti-tumorale di un vaccino a cellule dendritiche o DC basato su cellule staminali tumorali o CSC in un ospite immunocompetente. Questo obiettivo viene raggiunto isolando innanzitutto le CSC alor positive per l'aldeide deidrogenasi o ALDH ad alta attività da cellule tumorali eterogenee. Nel secondo passaggio, le DC derivate da CSC vengono isolate e quindi caricate con lisato per la preparazione del vaccino.

Successivamente, il lisato di CSC che attiva il vaccino DC o TP DC viene somministrato a ospiti immunocompetenti siringeneici normali. Quindi, nell'ultima fase, viene valutata l'efficacia protettiva antitumorale del vaccino C-S-C-T-P-D-C. Infine, è possibile eseguire un'ELI SA per valutare l'immunità anti-CSC indotta dal vaccino C-S-C-T-P-D-C attraverso le cellule T e gli anticorpi dell'ospite.

Questo progetto riunisce due delle aree più promettenti della ricerca sul cancro: quella delle cellule staminali tumorali e quella dell'immunoterapia antitumorale. Il nostro laboratorio è stato tra i primi a scoprire le cellule staminali tumorali nei tumori solidi. Queste sono i semi del cancro, responsabili della sua crescita e delle metastasi.

Quello che vedrete oggi è un nuovo approccio che utilizza l'immunoterapia per colpire in modo specifico queste cellule staminali tumorali. Utilizziamo un marcatore particolare chiamato aldeide deidrogenasi, che può essere rilevato mediante il saggio Alde fluoro. Vedrete i dottori Lin Liu e Huon Tau lavorare insieme al dottor Chow Lee.

Speriamo che mirando a queste cellule staminali tumorali, potremo migliorare l'esito per i pazienti affetti da molti tipi di cancro. Iniziare sospendendo le cellule tumorali di interesse nel buffer per saggio alor a una concentrazione di uno per dieci alla sesta cellule per millilitro. Trasferire quindi tutte le cellule tranne tre millilitri in ciascuna delle provette campione ed etichettare quattro provette di controllo in polistirene da 12 per 75 millimetri come segue: non colorata alor, ALOR più DEAB e sette A A D. Distribuire un millilitro della sospensione cellulare nelle provette non colorata e sette A A D e due millilitri nella provetta alde floor.

Quindi aggiungere cinque microlitri di DEAB nel tubo ALOR più DEAB. Porre i tubi sul ghiaccio e successivamente mescolare 10 microlitri di substrato alor attivato nel tubo alor. Trasferire immediatamente un millilitro della soluzione del substrato nel tubo ALOR più DEAB, quindi aggiungere due microlitri di substrato alor attivato per ogni milione di cellule in ciascuno dei tubi del campione.

Incubare tutti i tubi in un bagnomaria a 37 °C per 30 minuti, quindi aggiungere cinque microlitri di 7 A a D al tubo 7 A a D e un microlitro di 7 A a D per ogni milione di cellule in ciascun tubo del campione. Mantenere questi tubi a 4 °C per 10 minuti. Centrifugare tutti i tubi per cinque minuti a 250 ×g a temperatura ambiente e risospendere i pellet nel buffer per saggio Alde Fluor per l'ordinamento cellulare attivato da fluorescenza.

Per impostare i parametri di selezione, utilizzare le cellule alde Fluor più DEAB come controllo negativo e le cellule marcate con sette A a D come controllo di vitalità. Sulla base di questi controlli, definire un criterio di selezione per distinguere le cellule positive ad alor A LDH, D cinque elevato e SCC sette. Utilizzare quindi questo criterio per separare le cellule del campione in popolazioni positive ad alor A LDH, D cinque elevato e SCC sette.

Per generare le cellule dendritiche, isolare innanzitutto le ossa del femore e della tibia da un topo C57 Black Six e da un topo C3H. Sterilizzare le ossa in etanolo al 75% per un minuto a temperatura ambiente, quindi lavarle in HBSS. Successivamente, tagliare le estremità delle ossa e utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago da 21 gauge per lavare il midollo osseo in una piastra di Petri. Aspirare e rilasciare le cellule alcune volte per ottenere una sospensione di singole cellule, quindi centrifugare le cellule.

Incubare il pellet in cinque millilitri di tampone per la lisi dei globuli rossi per un minuto a 37 gradi Celsius in bagno termico. Dopo il conteggio cellulare, aggiustare il volume a uno per 10 alla sesta cellule per millilitro in mezzo di coltura integrato con G-M-C-S-F e IL-4. Quindi coltivare le cellule a 37 gradi Celsius e 5%CO2, rinnovando il mezzo e le citochine dopo tre giorni.

Al quinto giorno, raccogliere le cellule dendritiche immature. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere i pellet in cinque millilitri di mezzo di coltura e quindi stratificare lentamente la sospensione cellulare su un mezzo di isolamento appena preparato. Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, raccogliere le cellule dendritiche presenti tra il livello del mezzo di coltura e quello del mezzo di isolamento.

Successivamente, dopo aver contato le cellule, regolare il volume a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro nel mezzo di coltura, integrato con G-M-C-S-F e IL-4. Preparare ora i lisati tumorali sottoponendo le cellule ordinate a quattro cicli di congelamento e scongelamento rapido, seguiti da centrifugazione per raccogliere la frazione membranare dei lisati. Quindi esporre le DC al lisato ottenuto dalle cellule autologhe A LDH ad alto livello precedentemente ordinate. Per preparare le CSC TPC.

Per preparare il vaccino H-T-P-D-C, somministrare sottocutaneamente agli animali riceventi in esperimento 1 × 10⁶ cellule trattate, sospese in 100 µL di PBS, sul fianco sinistro di ciascun topo. Le cellule dendritiche vengono caricate con un lisato tumorale eterogeneo non ordinato. Dopo la vaccinazione, inoculare per via endovenosa 1 × 10⁵ cellule tumorali D5 eterogenee in 100 µL di PBS per sfidare i topi riceventi C57BL/6. Per il modello SCC7, sfidare i topi riceventi C3H con 1 × 10⁶ cellule tumorali SCC7 non ordinate, per via sottocutanea, in 100 µL di PBS, sul lato opposto rispetto al vaccino a base di cellule dendritiche.

Creare una sospensione di singole cellule a partire dalle milze dei topi ricorrenti C3H. Quindi attivare le cellule T e B spleniche con anticorpi monoclonali anti-CD3 e anti-CD28 immobilizzati in mezzo di coltura supplementato con lo stimolo appropriato. Dopo quattro giorni, raccogliere i soprannatanti e quindi rivestire le piastre ELISA con anticorpi contro interferone gamma, GM-CSF o IgG a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, bloccare la piastra per legame non specifico, aggiungere gli standard e i soprannatanti appena raccolti, quindi incubare le piastre a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio, aggiungere l'anticorpo di rilevamento HRP per un'ora e quindi aggiungere il substrato TMB.

Infine, misurare l'assorbanza con un lettore di piastre ELISA a 450 nanometri entro 30 minuti dall'arresto della reazione. Alor è stato utilizzato come marcatore per isolare cellule staminali in diverse neoplasie, inclusi i due popolamenti arricchiti di cellule staminali tumorali D cinque e SCC sette, specificamente come dimostrato in questi grafici a punti; le cellule positive per alor costituiscono rispettivamente circa lo 0,5% e il 5,2% delle linee cellulari tumorali coltivate D cinque e SCC sette. È stato inoltre determinato che cellule tumorali appena raccolte contengono rispettivamente il 2,5% e il 4,2% di cellule positive per alor provenienti da tumori D cinque e SCC sette stabiliti in vivo.

Le cellule tumorali trattate con D-E-A-B-A, un inibitore specifico della LDH A, sono state utilizzate come controllo negativo. L'immunogenicità delle cellule staminali tumorali è stata valutata esaminando l'immunità anti-tumorale protettiva indotta dai CSC TPCs mediante il modello di vaccinazione appena dimostrato. Come mostrato in questa tabella, i topi trattati con gli H TPCs hanno sviluppato meno metastasi polmonari rispetto ai topi trattati con PBS soltanto.

È importante notare che i topi trattati con PC di CSCT presentavano un numero ancora minore di metastasi polmonari rispetto agli animali trattati con H-T-P-D-C o con PBS da solo. Nel modello SCC sette, animali normali C3H sono stati vaccinati come appena descritto, in confronto al gruppo di controllo. Le H-TPC hanno indotto un'immunità antitumorale moderata, mentre le CSC-TPC hanno indotto un'inibizione significativa della crescita tumorale. Questi risultati indicano che le CSC potrebbero essere utilizzate come fonte di antigeni più efficace per il caricamento delle DC rispetto alle cellule tumorali tradizionali non ordinate, al fine di indurre un'immunità protettiva contro la sfida delle cellule tumorali.

Per approfondire i meccanismi alla base dell'immunità anti-tumorale protettiva indotta dalle CSC osservata, le citochine prodotte dai linfociti provenienti da animali vaccinati con cellule dendritiche sono state attivate e la loro produzione di citochine è stata misurata mediante EISA; come appena dimostrato, è stata rilevata una produzione significativamente maggiore di citochine da parte dei linfociti prelevati da animali vaccinati con D5 CSC TPC o SCCC7 CSC PC, rispetto a quelli prelevati da animali vaccinati con D5 HTPC o SCC7 HTC. Oggi hai visto come utilizzare il saggio Alor per isolare le cellule staminali tumorali.

Queste cellule staminali tumorali possono quindi essere utilizzate per sviluppare immunoterapie che sfruttano le cellule dendritiche. È nostra speranza che queste immunoterapie, utilizzate singolarmente o in combinazione con terapie esistenti, possano migliorare la prognosi per i pazienti affetti da molti tipi di cancro.