Indurre miointimale Iperplasia Versus aterosclerosi nei topi: Introduzione di due modelli validi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è presentare due modelli animali validi che portano a un restringimento dell'aorta attraverso meccanismi diversi. Il primo modello consiste nella cateterizzazione con palloncino dell'aorta per indurre lo sviluppo di iperplasia miointimale. Innanzitutto, l'aorta addominale infrarenale viene esposta e clampata.

Quindi l'aorta viene aperta con un'incisione trasversale e viene introdotto il catetere a palloncino. L'endotelio dell'aorta viene quindi asportato mediante il catetere gonfiato e l'intervento chirurgico viene completato. Il secondo modello consiste in una manipolazione dietetica di topi transgenici APOE null per indurre la formazione di placche aterosclerotiche.

Questi topi vengono allevati in condizioni standard e alimentati con una dieta occidentale ricca di lipidi per un periodo compreso tra quattro e sei mesi. L'analisi istologica dell'iperplasia intimale miocardica indotta chirurgicamente e del modello di restrizione dietetica mostra infine che questi due approcci determinano un restringimento luminale differente. Oggi vi illustreremo due modelli distinti per indurre il restringimento luminale: il modello murino mediante catetere a palloncino per provocare un danno vascolare e il modello di sclerosi arteriosa.

Utilizzando topi transgenici con una dieta occidentale, il modello di catetere a palloncino può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della stenosi. Il modello di topo transgenico omozigote per la mutazione nell'allele superiore E viene utilizzato per lo studio della patofisiologia dell'aterosclerosi. Per il modello di iperplasia intimale, procurarsi topi C57BL/6J del peso di circa 25 grammi.

Mantenerli in condizioni normali con una dieta standard. Dopo aver anestetizzato il topo con isoflurano al 2%, rimuovere i peli dell'addome e somministrare carprofene mediante iniezione sottocutanea per analgesia. Successivamente, disinfettare alternativamente la cute con provoiodio e etanolo al 80% in due cicli.

Ora verificare l'assenza di riflessi mediante una pinzatura del dito del piede. Iniziare l'intervento separando la cute e il muscolo lungo la linea alba. Successivamente, avvolgere gli intestini in un guanto inumidito con soluzione fisiologica, quindi, con attenzione, rimuovere il tessuto adiposo, esponendo l'aorta addominale.

Ora esporre l'aorta infrarenale fino alla sua biforcazione, avendo cura di non danneggiare i vasi collaterali. A questo punto clampare l'aorta.

Posizionare innanzitutto una pinza microchirurgica sull'aorta infrarenale prossimale per interrompere il flusso sanguigno. In secondo luogo, applicare una seconda pinza distale vicino alla biforcazione aortica. Una volta interrotto il flusso sanguigno, praticare un piccolo incisione sull'aorta in prossimità della pinza prossimale.

Inserire il catetere verso la pinza distale dell'aorta per provocare una lesione endoteliale. Denudare l'aorta gonfiando con attenzione il palloncino del catetere e tirando lentamente il catetere in direzione della pinza prossimale. Ripetere questa manovra due volte, per un totale di tre gonfiaggi dell'aorta.

Ora rimuovere il catetere e chiudere l'incisione aortica utilizzando punti continui in prolene 10-0. Con i punti già posizionati, aprire con attenzione il clamp distale se si verifica sanguinamento al sito di autotomia dell'aorta. Chiudere nuovamente il clamp, individuare la fonte del sanguinamento e fermarla con punti separati aggiuntivi.

In assenza di sanguinamento, aprire lentamente il morsetto prossimale. Dovrebbe essere visibile un polso aortico a valle dell'incisione. A questo punto, disporre i tessuti intestinali in C due.

Successivamente, chiudere la parete addominale a partire dallo strato muscolare utilizzando sei suture continue in OTT proline. Poi chiudere la cute con cinque suture OTT e trasferire il topo nella sua gabbia. Nei primi tre giorni postoperatori, somministrare metrazolo nell'acqua da bere per il controllo del dolore.

Monitorare l'animale per tutto il periodo di recupero, che dura circa 28 giorni. Per il modello di aterosclerosi, utilizzare topi deficienti di A POE di quattro settimane di età. Mantenere questi topi in condizioni standard con una dieta occidentale ricca di lipidi per quattro-sei mesi.

Mantenere questa dieta per tutta la durata dell'esperimento. Sei ore prima del prelievo dell'aorta, rimuovere l'accesso al cibo. Quindi preparare il topo per l'intervento chirurgico come descritto nella sezione precedente.

Iniziare l'intervento chirurgico aprendo il torace. Successivamente, asportare l'apice del cuore e perfondere sotto pressione delicata con tre millilitri di paraformaldeide al 4% attraverso la radice aortica per fissare l'aorta. Quindi, dissezionare l'aorta dalla radice fino alla sua biforcazione.

Cercare di rimuovere la maggior quantità possibile di tessuto adiposo. Successivamente, asportare l'arco aortico e conservarlo in paraformaldeide al 4%. Ora trasferire il cuore e l'albero aortico in una capsula di silicone contenente PBS.

Tagliare un'estremità dell'albero aortico e fissarla sullo strato di silicone con spilli fini. Aprire l'aorta longitudinalmente e lasciare il tessuto aortico in PBS a temperatura ambiente per alcuni minuti. Quindi risciacquare il tessuto una volta con etanolo al 50% e immergerlo in un bagno di Sudan.

Tre, colorazione con soluzione per circa 15 minuti. Dopo la colorazione, sciacquare rapidamente il tessuto con etanolo al 50% per alcuni secondi per rimuovere soltanto l'eccesso di Sudan. Uno sciacquo eccessivo rimuoverebbe troppo colorante; sciacquare immediatamente il tessuto con acqua distillata e procedere con l'acquisizione delle immagini. Per il modello di iperplasia miointimale, le aorte di topo denudate sono state prelevate, incluse in paraffina e colorate con cromo. I rapporti Im sono stati calcolati a partire dalle sezioni colorate con tricromo misurando lo spessore dell'intima e della media.

Utilizzando un'analisi al computer seguita dal calcolo del rapporto, lo spessore massimo della placca è stato misurato come lo spessore massimo della tonaca intima nel lume mediante morpho tree al computer. La percentuale di obliterazione luminale è stata calcolata come rapporto tra il nuovo lume interno e il lume precedente. L'area della placca è stata calcolata sottraendo il nuovo lume interno dal lume precedente.

Le stesse analisi sono state eseguite su sezioni trasversali colorate con tricromio del modello di aterosclerosi a livello della valvola aortica, dell'arco aortico e dell'aorta discendente, considerando soltanto il modello di aterosclerosi. L'aorta discendente è stata aperta longitudinalmente e colorata con rosso Sudan. L'area della placca e l'area totale dell'aorta sono state misurate con l'ausilio di un computer per l'analisi di entrambi i modelli.

Altri metodi, come l'istopatologia e la microscopia confocale a immunofluorescenza, possono essere eseguiti per rispondere a domande riguardanti l'obliterazione luminale, la morfologia e la cellularità. Grazie per averci guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.