Name: Indurre miointimale Iperplasia Versus aterosclerosi nei topi: Introduzione di due modelli validi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri due modelli murini per studiare l'iperplasia miointimale e l'aterosclerosi nell'aorta. Questi metodi permettono di analizzare i meccanismi di restringimento vascolare e sviluppo della placca.

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Gli autori ringraziano Christiane Pahrmann per l&#39;assistenza tecnica. SS ha ricevuto finanziamenti dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 e SCHR992/4-2).

Tutti i lavori degli animali deve essere effettuata secondo le pertinenti linee guida per la cura degli animali. Ottenere l&#39;approvazione istituzionale per il lavoro animale prima dell&#39;inizio del protocollo. 1. Miointimale Iperplasia Model (A) Per il modello iperplasia intimale, acquistare C57BL/6J (numero Archivio 000.664, C57BL/6J) topi all&#39;età di otto settimane del peso di circa 25 g. Topi Casa in questi esperimenti in condizioni convenzionali; nutrire topi chow mouse standard e fornire acqua ad libitum. <ol><li> Preparazione Mouse: Introdurre il mouse per uno stato anestetico con isoflurano (2%) utilizzando una camera di induzione. <ol><li> Rimuovere i capelli addominale utilizzando un trimmer capelli, gettare il mouse sulla sua schiena e coprire il naso e la bocca con la maschera facciale per assicurare la anestesia. </li><li> Con Provo-Iodio, disinfettare la zona addominale universalmente, seguito dal 80% di etanolo, in due cicli. </li><li> Garantire l&#39;assenzadei riflessi pizzicando dell&#39;arto posteriore per controllare la profondità sufficiente dell&#39;anestesia. </li><li> Separare la pelle ei muscoli lungo la linea alba in due fasi per esporre gli organi addominali. </li><li> Posare l&#39;intestino in un guanto salina idratata. Avvolgere il guanto intorno l&#39;intestino per mantenerli umidi. </li><li> Attentamente sgombrare il tessuto adiposo pezzo per pezzo l&#39;aorta addominale. Esporre l&#39;aorta sottorenale fino alla sua biforcazione, facendo attenzione a non danneggiare alcuna navi filiali. </li><li> Innanzitutto, collocare un morsetto microchirurgico sul prossimale, sottorenale per arrestare il flusso di sangue. Ora, applicare un secondo morsetto distale vicino alla biforcazione aortica. </li><li> Quando il flusso di sangue viene interrotto, fare una piccola incisione nell&#39;aorta vicino al morsetto prossimale. </li><li> Inserire il catetere a palloncino con punta, che è stata idratata con 0,9% di soluzione salina, e avanzare verso il morsetto distale dell&#39;aorta. </li><li> Per il danno endoteliale, denudare l&#39;aorta gonfiando il Balloon lentamente e tirando il catetere nella direzione del morsetto prossimale. </li><li> Ripetere la manovra denudazione due volte. </li><li> Rimuovere il catetere e chiudere l&#39;incisione aortica utilizzando 10-0 prolene suture in esecuzione. </li><li> Aprire con cautela il morsetto distale. In caso di sanguinamento nel sito aortotomy, chiudere il morsetto di nuovo, individuare l&#39;emorragia e mettere ulteriori punti interrotti, se necessario. </li><li> Se nessun sanguinamento può essere osservato, aprire lentamente il morsetto prossimale. </li><li> Un impulso aortico deve essere visibile distalmente dall&#39;incisione. Ora gli intestini possono essere organizzati indietro in situ. </li><li> Sciacquare la cavità addominale utilizzando soluzione fisiologica sterile pre-riscaldato. </li><li> Chiudere la parete addominale che inizia con lo strato muscolare con 6-0 punti di sutura prolene esecuzione. </li><li> Accanto adeguare la pelle sotto l&#39;uso di 5-0 prolene eseguire suture in esecuzione. </li><li> Durante il tempo il mouse è ancora anestetizzato, applicare 4-5 mg / kg Carprofene tramite un inje sottocutaneaction. </li><li> Aggiungi Metamizol l&#39;acqua potabile (50 mg Metamizol per 100 ml) per il controllo del dolore e proseguire per tre giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. Controllo degli animali durante il ricovero. Nota: Il periodo di osservazione per questo modello è di 28 giorni. </li></ol></li></ol> 2. Aterosclerosi Model (B) Per il modello aterosclerosi, l&#39;acquisto di apolipoproteina E-deficienti (ApoE - / -) topo (numero Archivio 002.052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) ad un&#39;età di 4 settimane, e poi alimentato per 4-6 mesi. Topi Casa in questi esperimenti in condizioni convenzionali; nutrire topi dieta ad alto contenuto di lipidi occidentale all&#39;arrivo (Harlan Laboratories TD.88137) e fornire acqua ad libitum per una durata di 4-6 mesi. <ol><li> Preparazione Mouse: <ol><li> Feed the ApoE - / - topi con dieta occidentale con inizio alle 4 settimane di età. Manipolazione alimentare deve iniziare direttamente all&#39;arrivo. </li><li> Mantenere la dieta occidentale per tutta la durata dell&#39;esperimento. &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 3. Analisi <ol><li> Modello iperplasia miointimale (A) La regione di interesse in questo modello è la &quot;zona lesione&quot;. Opzioni per analisi comprendono obliterazione del lume, rapporto I / M (rapporto intima / media), spessore myointima massimo, zona miointimale, Colorazione tricromica di fibrosi e colorazione H &amp; E per cellule mononucleari (come illustrato nelle Figure 1A-1C). Secondo la domanda scientifica numerose altre colorazioni come Picrosirius rosso per il collagene, immunoistochimica e metodi confocale possono essere applicati. </li><li> Modello di aterosclerosi (B) Le regioni di interesse in questo modello sono la valvola aortica, arco aortico e l&#39;aorta discendente. Opzioni per l&#39;analisi: il Sudan colorazione rosso per i lipidi e la colorazione tricromica di valvola aortica, arco aortico e aorta discendente (come illustrato in Fig. 1D). Questo modello produce anche una varietà di altre opzioni come colorazioneper esempio Oil Red O di lipidi neutri, Picrosirius rosso, immunoistochimica e metodi confocale. <ol><li> Sudan colorazione rosso: Eseguire la colorazione rossa Sudan sul tessuto aortico appena raccolte. <ol><li> Rimuovere la 6h dieta prima della raccolta. </li><li> Introdurre il mouse per uno stato anestetico con isoflurano (2%) utilizzando una camera di induzione. Garantire l&#39;assenza di riflessi pizzicando dell&#39;arto posteriore per controllare la profondità sufficiente dell&#39;anestesia. </li><li> Aprite la cassa; tagliare la punta del cuore e perfusione attraverso il ventricolo sinistro, prima con soluzione salina (3 ml), seguito da 4% PFA (3 ml) attraverso la radice aortica per fissare l&#39;aorta. </li><li> Liberare l&#39;aorta dalla radice alla sua biforcazione. Prova per rimuovere il tessuto adiposo, per quanto possibile. </li><li> Tagliare il cuore e la radice aortica, e memorizzarli nel 4% PFA per istologia. </li><li> Per l&#39;istologia della radice aortica deve essere attentamente collocato nel blocco di paraffina in posizione verticale per permettere il taglio della aortic diapositive di generazione radice che mostrano tutte e 3 lembi valvolari. </li><li> Tagliare un&#39;estremità dell&#39;albero aortica e fissarlo sullo strato di silicone con perni sottili. Aprire l&#39;aorta longitudinalmente e fissare il tessuto aortico. </li><li> Lavare il tessuto con il 50% di etanolo. Immergere il tessuto con la soluzione colorante Sudan III per circa 15 min. </li><li> Risciacquare leggermente con il 50% di etanolo per rimuovere l&#39;eccesso Sudan III. (Nota: il 50% di etanolo può lavare via il colorante.) Sciacquare con dH 2 O, e scattare foto per ulteriori analisi. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+cardiovascular+disease+in+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Burden of cardiovascular disease in Canada.</a> Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).</li>
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<li>Nitschke, Y., Weissen-Plenz, G., Terkeltaub, R., Rutsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Npp1+promotes+atherosclerosis+in+ApoE+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular%22%5BJournal%5D)">Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice.</a> Journal of cellular and molecular. 15, 2273-2283 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sebbene entrambe le malattie provocano sintomi simili nel paziente, i meccanismi alla base dello sviluppo della placca e quindi i metodi di trattamento sono molto diversi 2. In diverse forme di stenosi arteriosa risultati clinici nei pazienti nonché i tempi di sviluppo placca dipendono dal meccanismo sottostante. A seconda dei risultati clinici nel paziente, diversi metodi di analisi dei campioni devono essere eseguite 5,15. È necessario adattare l&#39;analisi ai riliev...

Nei paesi industrializzati la cardiopatia ischemica rimane una delle principali cause di mortalità ad 1. Le cause di stenosi dell&#39;arteria coronaria sono molteplici e includono iperplasia miointimale così come aterosclerosi, con rivascolarizzazione rimanendo la strategia di trattamento più comune 2. Modelli di ricerca che distinguono chiaramente tra le vie meccanicistiche di iperplasia intimale e aterosclerosi sono essenziali per indagare il patobiologico e processi fisiopatologici in arterioso sviluppo della placca. In questo video vengono introdotti due modelli murini diversi utilizzati per studiare sia lo sviluppo di iperplasia miointimale o aterosclerosi. Iperplasia miointimale è postulata per formare tramite il paradigma &quot;risposta a lesioni&quot;, originariamente descritta per l&#39;aterosclerosi 3. La distruzione meccanica dello strato endoteliale porta ad un rimodellamento intenso arricchito da effetti paracrini. Ci sono diversi dimodelli animali fferent comunemente utilizzati per studiare iperplasia miointimale. Alcuni gruppi usano dispositivi metallici in aorta ascendente di ratti 4. Il modello denudazione aortica eseguita con un catetere a palloncino viene anche comunemente usato nei ratti di laboratorio 5,6. Il modello di iperplasia intimale eseguita nei topi di laboratorio 7 implementa legatura della carotide e induce lesioni miointimale 8. Nel nostro laboratorio, il modello denudamento aortico addominale - per studiare lo sviluppo di iperplasia miointimale - così come un modello umanizzato stent restenosi 9 sono comunemente usati. Questo video sottolinea che la scelta del corretto modello sperimentale animale è di fondamentale importanza per gli studi meccanicistici o fisiopatologiche di stenosi arteriosa. Modelli iperplasia miointimale devono essere distinti dai modelli aterosclerosi. Per questi ultimi, apolipoproteina E-deficienti (ApoE - / -) topi in combinazione con dieta occidentale sono comunemente usati per indurre atheroscllesioni erotici 10,11,12,13. Esempi per l&#39;induzione di entrambi questi tipi di malattie miointimale in topi sono mostrati qui, insieme con differenti opzioni del modello adattato per analizzare stenosi 14.

<table><tbody><tr><td>Brodo di tioglicolato 3%</td><td>Fluka</td><td>70157</td><td>polvere</td></tr><tr><td>PFA 4%</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>#157135S</td><td>20%</td></tr><tr><td>Sudan III soluzione colorante</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S4131</td><td></td></tr><tr><td>polvere di topo C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Stock # 0006664</td><td></td></tr><tr><td>mouse ApoE -/-</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Stock #002052</td><td></td></tr><tr><td>Western Diet</td><td>Harlan Laboratories</td><td>TD.88137</td><td></td></tr><tr><td>tagliacapelli</td><td>WAHL</td><td>8786-451A ARCO SE</td><td></td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott</td><td></td> Morsetto microchirurgico per <td>isoflurano</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-04</td><td>Micro-Serrefine -</td></tr><tr><td>Applicatore a morsetto</td> da 4 mm <td>Catetere</td><td></td> Fine Science Tools 18056-14 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura 10-0 in prolene</td><td>Ethicon</td><td>788G</td><td></td></tr><tr><td>Sutura in prolene 6-0</td><td>Ethicon</td><td>8709H</td><td></td></tr><tr><td>Sutura in prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>EH7229H</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Carprofene</td></tr><tr><td>Metacam 1,5 mg/ml</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td>Metamizol</td></tr></tbody></table>

indurre miointimale iperplasia versus aterosclerosi nei topi: introduzione di due modelli validi

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

Vari vivo modelli di roditori di laboratorio in per l&#39;induzione di stenosi sono state stabilite per simulare malattie che comprendono la formazione di placca arteriosa e stenosi, come osservato ad esempio cardiopatia ischemica. Due modelli del mouse altamente riproducibili - sia conseguente stenosi ma ognuno alla base di un diverso percorso di sviluppo - vengono introdotti qui. I modelli rappresentano le due più comuni cause di stenosi dell&#39;arteria; cioè sono mostrati uno per ogni modello di topo iperplasia miointimale e aterosclerosi. Causare iperplasia miointimale, viene eseguita una lesione catetere a palloncino dell&#39;aorta addominale. Per lo sviluppo della placca aterosclerotica, l&#39;ApoE - è utilizzata modello del mouse in combinazione con dieta grassa occidentale - /. Diverse opzioni di modelli adattati per la misurazione e la valutazione dei risultati sono nominati e descritti in questo manoscritto. L&#39;introduzione e il confronto di questi due modelli fornisce information per gli scienziati di scegliere il modello di stenosi dell&#39;arteria adeguato in conformità alla questione scientifica posta.

La figura 1 mostra diverse opzioni di analisi e lo stato di malattia indotta per entrambi i modelli. Per il modello iperplasia intimale, viene mostrata l&#39;analisi di sezioni rappresentative trasversali in colorazione tricromica. Da queste sezioni trasversali, risultati come rapporti I / M, spessore massimo placca, spessore intimale massimo nel lume, obliterazione del lume in percentuale, così come l&#39;area della placca possono essere misurate e calcolate. Per valutare i...

Questo video mostra due modelli di intimale sviluppo placca nelle arterie murini e sottolinea le differenze di iperplasia miointimale e aterosclerosi.

Indurre miointimale Iperplasia Versus aterosclerosi nei topi: Introduzione di due modelli validi

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è presentare due modelli animali validi che portano a un restringimento dell'aorta attraverso meccanismi diversi. Il primo modello consiste nella cateterizzazione con palloncino dell'aorta per indurre lo sviluppo di iperplasia miointimale. Innanzitutto, l'aorta addominale infrarenale viene esposta e clampata.Quindi l'aorta viene aperta con un'incisione trasversale e viene introdotto il catetere a palloncino. L'endotelio dell'aorta viene quindi asportato mediante il catetere gonfiato e l'intervento chirurgico viene completato. Il secondo modello consiste in una manipolazione dietetica di topi transgenici APOE null per indurre la formazione di placche aterosclerotiche.Questi topi vengono allevati in condizioni standard e alimentati con una dieta occidentale ricca di lipidi per un periodo compreso tra quattro e sei mesi. L'analisi istologica dell'iperplasia intimale miocardica indotta chirurgicamente e del modello di restrizione dietetica mostra infine che questi due approcci determinano un restringimento luminale differente. Oggi vi illustreremo due modelli distinti per indurre il restringimento luminale: il modello murino mediante catetere a palloncino per provocare un danno vascolare e il modello di sclerosi arteriosa.Utilizzando topi transgenici con una dieta occidentale, il modello di catetere a palloncino può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della stenosi. Il modello di topo transgenico omozigote per la mutazione nell'allele superiore E viene utilizzato per lo studio della patofisiologia dell'aterosclerosi. Per il modello di iperplasia intimale, procurarsi topi C57BL/6J del peso di circa 25 grammi.Mantenerli in condizioni normali con una dieta standard. Dopo aver anestetizzato il topo con isoflurano al 2%, rimuovere i peli dell'addome e somministrare carprofene mediante iniezione sottocutanea per analgesia. Successivamente, disinfettare alternativamente la cute con provoiodio e etanolo al 80% in due cicli.Ora verificare l'assenza di riflessi mediante una pinzatura del dito del piede. Iniziare l'intervento separando la cute e il muscolo lungo la linea alba. Successivamente, avvolgere gli intestini in un guanto inumidito con soluzione fisiologica, quindi, con attenzione, rimuovere il tessuto adiposo, esponendo l'aorta addominale.Ora esporre l'aorta infrarenale fino alla sua biforcazione, avendo cura di non danneggiare i vasi collaterali. A questo punto clampare l'aorta.Posizionare innanzitutto una pinza microchirurgica sull'aorta infrarenale prossimale per interrompere il flusso sanguigno. In secondo luogo, applicare una seconda pinza distale vicino alla biforcazione aortica. Una volta interrotto il flusso sanguigno, praticare un piccolo incisione sull'aorta in prossimità della pinza prossimale.Inserire il catetere verso la pinza distale dell'aorta per provocare una lesione endoteliale. Denudare l'aorta gonfiando con attenzione il palloncino del catetere e tirando lentamente il catetere in direzione della pinza prossimale. Ripetere questa manovra due volte, per un totale di tre gonfiaggi dell'aorta.Ora rimuovere il catetere e chiudere l'incisione aortica utilizzando punti continui in prolene 10-0. Con i punti già posizionati, aprire con attenzione il clamp distale se si verifica sanguinamento al sito di autotomia dell'aorta. Chiudere nuovamente il clamp, individuare la fonte del sanguinamento e fermarla con punti separati aggiuntivi.In assenza di sanguinamento, aprire lentamente il morsetto prossimale. Dovrebbe essere visibile un polso aortico a valle dell'incisione. A questo punto, disporre i tessuti intestinali in C due.Successivamente, chiudere la parete addominale a partire dallo strato muscolare utilizzando sei suture continue in OTT proline. Poi chiudere la cute con cinque suture OTT e trasferire il topo nella sua gabbia. Nei primi tre giorni postoperatori, somministrare metrazolo nell'acqua da bere per il controllo del dolore.Monitorare l'animale per tutto il periodo di recupero, che dura circa 28 giorni. Per il modello di aterosclerosi, utilizzare topi deficienti di A POE di quattro settimane di età. Mantenere questi topi in condizioni standard con una dieta occidentale ricca di lipidi per quattro-sei mesi.Mantenere questa dieta per tutta la durata dell'esperimento. Sei ore prima del prelievo dell'aorta, rimuovere l'accesso al cibo. Quindi preparare il topo per l'intervento chirurgico come descritto nella sezione precedente.Iniziare l'intervento chirurgico aprendo il torace. Successivamente, asportare l'apice del cuore e perfondere sotto pressione delicata con tre millilitri di paraformaldeide al 4% attraverso la radice aortica per fissare l'aorta. Quindi, dissezionare l'aorta dalla radice fino alla sua biforcazione.Cercare di rimuovere la maggior quantità possibile di tessuto adiposo. Successivamente, asportare l'arco aortico e conservarlo in paraformaldeide al 4%. Ora trasferire il cuore e l'albero aortico in una capsula di silicone contenente PBS.Tagliare un'estremità dell'albero aortico e fissarla sullo strato di silicone con spilli fini. Aprire l'aorta longitudinalmente e lasciare il tessuto aortico in PBS a temperatura ambiente per alcuni minuti. Quindi risciacquare il tessuto una volta con etanolo al 50% e immergerlo in un bagno di Sudan.Tre, colorazione con soluzione per circa 15 minuti. Dopo la colorazione, sciacquare rapidamente il tessuto con etanolo al 50% per alcuni secondi per rimuovere soltanto l'eccesso di Sudan. Uno sciacquo eccessivo rimuoverebbe troppo colorante; sciacquare immediatamente il tessuto con acqua distillata e procedere con l'acquisizione delle immagini. Per il modello di iperplasia miointimale, le aorte di topo denudate sono state prelevate, incluse in paraffina e colorate con cromo. I rapporti Im sono stati calcolati a partire dalle sezioni colorate con tricromo misurando lo spessore dell'intima e della media.Utilizzando un'analisi al computer seguita dal calcolo del rapporto, lo spessore massimo della placca è stato misurato come lo spessore massimo della tonaca intima nel lume mediante morpho tree al computer. La percentuale di obliterazione luminale è stata calcolata come rapporto tra il nuovo lume interno e il lume precedente. L'area della placca è stata calcolata sottraendo il nuovo lume interno dal lume precedente.Le stesse analisi sono state eseguite su sezioni trasversali colorate con tricromio del modello di aterosclerosi a livello della valvola aortica, dell'arco aortico e dell'aorta discendente, considerando soltanto il modello di aterosclerosi. L'aorta discendente è stata aperta longitudinalmente e colorata con rosso Sudan. L'area della placca e l'area totale dell'aorta sono state misurate con l'ausilio di un computer per l'analisi di entrambi i modelli.Altri metodi, come l'istopatologia e la microscopia confocale a immunofluorescenza, possono essere eseguiti per rispondere a domande riguardanti l'obliterazione luminale, la morfologia e la cellularità. Grazie per averci guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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