Istituzione e Ottimizzazione di un programma di installazione High Throughput per studiare Staphylococcus epidermidis E Mycobacterium marinum Infezione come modello per Drug Discovery
26 giugno 2014
In questo articolo video descrive l'alta velocità oleodotto che è stato stabilito con successo per infettare e analizzare un gran numero di embrioni di zebrafish fornire un nuovo potente strumento per il test composto e la scoperta di farmaci utilizzando un intero organismo vertebrato.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare un gran numero di embrioni di pesce zebra infetti per test di composti ad alto rendimento per consentire la scoperta di farmaci. Ciò si ottiene utilizzando prima una grande nave da riproduzione per ottenere un gran numero di uova sincrone di zebrafish in un singolo evento. Successivamente, le uova vengono allineate in una griglia aros e infettate con batteri nel tuorlo utilizzando un micro iniettore automatizzato.
Quando l'infezione si è diffusa attraverso gli embrioni, questi vengono preselezionati mediante citometria a flusso di particelle di grandi dimensioni prima di essere trattati con farmaci. Infine, i livelli di carica batterica negli embrioni infetti vengono analizzati dopo il trattamento composto. In definitiva, analisi ad alta risoluzione attraverso microscopia confocale vertebrale.
Lo screening automatizzato e il campionamento di particelle di grandi dimensioni vengono utilizzati per mostrare con maggiore dettaglio gli effetti che i composti hanno sull'infezione. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti come le iniezioni manuali o l'analisi PIX, è che con esso possiamo generare una grande quantità di embrioni affetti in modo omogeneo, che possiamo analizzare in modo ad alto rendimento. Per preparare l'inoculo di S epiderm, isolare diverse colonie individuali da una piastra di ceppo di S epiderm, O 47 contenente un vettore di espressione di ciliegia M derivato da PW VW 180 9 e inoculare.
25 millilitri di LB integrati con 10 microgrammi per millilitro. Incubare il cloramfenicolo per una notte a 37 gradi Celsius fino allo stadio intermedio il giorno successivo, centrifugare un millilitro di coltura a 12.000 GS per un minuto e utilizzare un millilitro di PBS sterile con lo 0,3% di volume per volume tra 80 per lavare il pellet tre volte. Misurare la densità ottica a OD 600 e utilizzare il 2% in peso per volume, il polivinilperone 40 o il PVP 40 in PBS per diluire la sospensione batterica a un OD 600 pari a 0,3 o una volta 10 alle otto CFU per millilitro.
Per preparare l'inoculo di aminum, isolare diverse colonie individuali dal ceppo M Meum M o E 11 che esprimono stabilmente il vettore di ciliegia PS MT 3M da un aerato Middlebrook seven H 10 e inoculare 10 millilitri di brodo Middlebrook seven H nine contenente il 10% di volume per volume. L'arricchimento DC Middlebrook A integrato con 50 microgrammi per millilitro di igromicina incuba per una notte a 28 gradi Celsius il giorno successivo. Centrifugare un millilitro di coltura a 12.000 GS per un minuto e utilizzare un millilitro di PBS sterile con lo 0,3% di volume per volume tra 80 per lavare il pellet tre volte.
Misurare il diametro esterno 600 della sospensione batterica e con il 2% in peso per volume. PVP 40 in PBS diluito a un OD 600 di 0,3 o 0,3 volte 10 alle otto CFU per millilitro per ottenere uova di pesce zebra la notte prima della raccolta, posizionare un massimo di 50 femmine di pesce zebra nella camera inferiore di un grande recipiente da riproduzione e 70 maschi nella parte superiore del vaso. La mattina successiva, rimuovere il separatore dal recipiente Dopo circa un'ora attraverso il raccoglitore di uova sul fondo del recipiente di riproduzione, raccogliere le uova in un tubo da 50 millilitri riempito con acqua d'uovo.
Dopo aver preparato le piastre di iniezione, secondo il protocollo di testo sul software operativo automatizzato del micro iniettore, fare clic sulla fase di calibrazione, quindi fare clic su 10 24. Griglia del pozzetto e posiziona la piastra aros nel micro iniettore, calibra la piastra cliccando sullo schermo nella posizione centrale del pozzetto. Quindi vai al menu dell'ago e fai clic su calibra portaago.
Utilizzando una punta per micro caricatore, riempire un ago per iniezione con punta di 10 micron di diametro con 10 microlitri di PVP 40 contenente 100 CFU per nanolitro di S epiderma, 30 CFU per nanolitro di siero o PVP 40 da solo per le iniezioni simulate, posizionare l'ago nel micro iniettore automatizzato e calibrare la posizione XY abbassando o spostando l'ago verso l'alto e facendo clic sullo schermo nella posizione dell'ago. Quindi calibrare la posizione Z dell'ago facendo clic sullo schermo nella posizione della punta dell'ago. Quindi, utilizzare una pipetta di plastica per distribuire le uova sulla griglia aros e rimuovere l'acqua in eccesso.
Quindi posizionare la griglia agros piena di uova nel micro iniettore automatizzato nel menu di iniezione, regolare l'impostazione della pressione di iniezione su 200 ettari pascal, il tempo di iniezione a 0,2 secondi e la pressione di compensazione a 15 Hector Pascals, che è correlata a un nanolitro nel menu delle impostazioni del getto Femto. Fare clic su iniettare tutto e iniettare l'intera piastra di embrioni dopo l'iniezione. Raccogli le uova lavandole in una capsula di Petri e incubale a 28 gradi Celsius.
Una volta configurato il citometro a flusso di particelle di grandi dimensioni, accedere al menu PMT e impostare il canale rosso a 650 volt e i canali verde e giallo a zero volt. Quindi, all'interno del menu delle soglie, impostare il segnale di soglia della densità ottica su 50, corrispondente a 975 millivolt e il tempo di volo minimo a 800, corrispondente a 320 microsecondi. Per ridurre l'influenza dei detriti, posizionare gli embrioni nella tazza del campione e nel menu di ordinamento per trovare il massimo di 70 embrioni per piastra da smistare inserendo 70.
Posiziona una capsula di Petri vuota sotto lo smistatore e fai clic su ordina manualmente. Quando la capsula di Petri è piena, salvare i dati facendo clic su memorizza. Se è necessaria un'analisi o un imaging ad alta risoluzione, gli embrioni possono essere ordinati singolarmente in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
Posizionare gli embrioni nella tazza del campione e definire il massimo di un embrione per pozzetto da selezionare. Quindi posizionare una piastra vuota da 96 pozzetti nel portapiastra sinistro e fare clic sulla piastra di riempimento. Quando la piastra è piena, salva i dati facendo clic su Memorizza per analizzare gli embrioni trattati con il farmaco tre giorni dopo l'iniezione con erum.
Trattare un gruppo di embrioni con un composto di interesse in solvente e un secondo gruppo con solo solvente. Posizionare gli embrioni trattati a quattro e cinque giorni dopo la fecondazione nella coppa del campione sul citometro a flusso e impostare la selezione a 70 embrioni per piastra dopo aver anestetizzato gli embrioni in trica e aver impostato il sistema di screening automatizzato dei vertebrati e il campionatore di particelle di grandi dimensioni. In base al protocollo di testo dal menu di configurazione del rilevamento degli oggetti di imaging, selezionare le immagini di riferimento corrispondenti all'età degli embrioni nel menu di memorizzazione automatica delle immagini di imaging, selezionare il numero di immagini da creare e l'orientamento da utilizzare.
Posizionare una piastra a 96 pozzetti riempita di embrioni nel supporto sinistro del campionatore di particelle grande e fare clic sulla piastra di esecuzione. Quando un embrione è posizionato correttamente, utilizzare un obiettivo a secco 10 x e visualizzare separatamente la testa e la coda. Quindi utilizzare un software di elaborazione delle immagini per unire le immagini per valutare quale stadio di sviluppo è il migliore per l'infezione da tuorlo.
Sono state eseguite iniezioni con dermite e marum in tutti i diversi stadi tra quello di una e quella di 512 cellule. Come si vede qui, le iniezioni con 100 CFU di dermite eseguite tra lo stadio di 16 e 128 cellule hanno fornito il miglior modello di infezione. I batteri proliferavano all'interno del tuorlo per tre giorni e si diffondevano nel corpo da tre giorni dopo l'infezione in poi.
La quantificazione ad alto rendimento della carica batterica è stata eseguita mediante analisi dell'intensità della fluorescenza utilizzando il citometro a flusso di particelle di grandi dimensioni. Come mostrato qui, la quantità di batteri vivi presenti all'interno dell'embrione corrisponde molto bene al segnale fluorescente misurato. Questa cifra dimostra che lo stadio di sviluppo ottimale per l'iniezione di 30 CFU di aminum è compreso tra lo stadio di 16 e 128 cellule per il ceppo E 11 e tra lo stadio di 16 e 64 cellule.
Con il ceppo EM più virulento, gli embrioni iniettati in queste fasi hanno mostrato una crescita batterica all'interno della quercia e la diffusione dei batteri attraverso l'embrione. Dopo il trattamento pre-pregresso di embrioni infetti da emerina con diverse concentrazioni di rifampicina ha mostrato una riduzione dell'infezione micobatterica in modo dose-dipendente. L'uso del farmaco alla dose di 200 micromolari ha dimostrato di aver efficacemente fermato la progressione batterica di M mein E 11, 24 ore e oltre dopo il trattamento Dopo il suo sviluppo.
Queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo della sperimentazione dei composti e dello sviluppo di farmaci, alla ricerca di nuovi trattamenti per malattie infettive come la tubercolosi o le infezioni associate ai biomateriali.
Panoramica
Questo articolo video descrive una pipeline ad alto rendimento stabilita per infettare e analizzare un gran numero di embrioni di zebrafish, fornendo uno strumento potente per il test di composti e la scoperta di farmaci.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Scopritura di farmaci
- Biologia delle infezioni
Sfondo
- Gli embrioni di zebrafish sono utilizzati come organismo modello per lo studio delle infezioni.
- I metodi ad alto rendimento consentono l'analisi di campioni di grandi dimensioni.
- Le tecniche automatizzate migliorano l'efficienza e la coerenza negli esperimenti.
- Il test di farmaci su embrioni infetti può rivelare l'efficacia dei composti.
Obiettivo dello studio
- Generare un gran numero di embrioni di zebrafish infetti per i test.
- Analizzare gli effetti dei composti sulle infezioni batteriche.
- Migliorare i processi di scoperta di farmaci utilizzando un modello vertebrato.
Metodi utilizzati
- Utilizzo di un grande recipiente di allevamento per la raccolta sincrona delle uova.
- Microiniezione automatizzata di batteri nel sacco vitellino dello zebrafish.
- Citometria a flusso di particelle grandi per lo smistamento degli embrioni.
- Microscopia confocale per l'analisi ad alta risoluzione delle infezioni.
Principali risultati
- L'infezione riuscita degli embrioni permette un'analisi ad alto rendimento.
- I metodi automatizzati producono embrioni omogeneamente affetti.
- Gli effetti del trattamento farmacologico possono essere valutati quantitativamente.
- L'imaging ad alta risoluzione rivela interazioni dettagliate tra composti e infezioni.
Conclusioni
- La pipeline stabilita migliora significativamente gli sforzi di scoperta di farmaci.
- Le tecniche automatizzate forniscono risultati affidabili e riproducibili.
- Questo metodo può essere adattato per vari scenari di test di composti.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This high throughput zebrafish infection model bridges the gap between cell-based assays and mammalian in vivo validation, enabling early-stage compound screening with whole-animal physiological relevance. By generating large numbers of synchronously infected embryos, the method supports predictive confidence in target validation and reduces late-stage attrition in anti-infective drug discovery pipelines. The scalable workflow accommodates diverse bacterial pathogens and compound libraries, enhancing translational continuity from hit identification to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a whole-animal infection context, clarifying pathogen-host interactions and target essentiality.
- Operational Value: Supports biological de-risking through homogeneous, synchronized infection models that reduce variability in phenotypic screening outcomes.
- Predictive Value: Facilitates early go/no-go decisions by quantifying compound effects on bacterial burden in vivo, improving portfolio triage efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems amenable to downstream compound evaluation.
- Operational Value: Employs automated microinjection and large particle flow cytometry to ensure assay consistency, scalability, and high sample throughput.
- Screening Readiness: Generates quantitative fluorescence-based readouts of bacterial burden, enabling reliable dose-response analysis and hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by modeling Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infections, which reflect biomaterial-associated and tuberculosis-related pathologies.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking early efficacy signals to known antimicrobial mechanisms, such as rifampicin dose-dependent inhibition.
- Mechanistic De-risking: Enables use of transgenic zebrafish lines to decipher compound mode of action, strengthening target confidence before mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for anti-infective programs requiring whole-animal validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time monitoring of infection dynamics and compound interference in a vertebrate host.
- Screening: Delivers assay readiness through automated embryo alignment, precise yolk injection, and presorting via flow cytometry to ensure uniform starting conditions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements via fluorescence intensity analysis, allowing objective comparison of bacterial burden across treatment groups.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through dose-response profiling of known antibiotics, establishing predictive biomarkers of efficacy.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening diverse compound libraries against multiple pathogens, reducing reliance on bespoke assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of infection modulation in vivo.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability through automated workflows and synchronized embryo production.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in anti-infective programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative in vivo efficacy data from high throughput screens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection techniques, and flow cytometry operation.
- Dependent on automated microinjectors, large particle flow cytometers, and fluorescence detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of infection protocols, compound preparation, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, transgenic lines, and infection readouts based on pathogen virulence and host response.
- Practical limitations include embryo viability constraints post-infection and the need for optimization of bacterial inoculum titers for consistent phenotype penetration.
