Istituzione e Ottimizzazione di un programma di installazione High Throughput per studiare
26 giugno 2014
In questo articolo video descrive l'alta velocità oleodotto che è stato stabilito con successo per infettare e analizzare un gran numero di embrioni di zebrafish fornire un nuovo potente strumento per il test composto e la scoperta di farmaci utilizzando un intero organismo vertebrato.
L'obiettivo generale di questa procedura è generare un elevato numero di embrioni di pesce zebra infetti per test ad alto rendimento di composti, al fine di favorire la scoperta di farmaci. Questo risultato si ottiene innanzitutto utilizzando un contenitore di riproduzione di grandi dimensioni per ottenere un elevato numero di uova di pesce zebra sincrone in un singolo evento. Successivamente, le uova vengono allineate in una griglia aros e infettate con batteri nel tuorlo mediante un microiniettore automatico.
Quando l'infezione si è diffusa negli embrioni, questi vengono preselezionati mediante citometria a flusso per particelle di grandi dimensioni prima di essere trattati con farmaci. Infine, i livelli di carico batterico negli embrioni infetti vengono analizzati dopo il trattamento con il composto. In ultima analisi, un'analisi ad alta risoluzione viene effettuata mediante microscopia confocale della vertebra.
Lo screening automatizzato e il campionamento di particelle di grandi dimensioni vengono utilizzati per mostrare in maggiore dettaglio gli effetti che i composti esercitano sull'infezione. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto alle tecniche esistenti, come le iniezioni manuali o l'analisi con PIX scan, è che consente di generare un elevato numero di embrioni omogeneamente colpiti, che possono essere analizzati in modo ad alto rendimento. Per preparare il ceppo inocuo di S epiderm, isolare diverse colonie singole da una piastra di ceppo S epiderm, O 47 contenente il vettore di espressione A PW VW 180 9 derivato da M cherry, e inoculare.
25 millilitri di LB integrato con 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo, incubare per una notte a 37 gradi Celsius fino alla fase di crescita logaritmica media; il giorno seguente, centrifugare un millilitro della coltura a 12.000 ×g per un minuto ed usare un millilitro di PBS sterile con 0,3% volume/volume di tween 80 per lavare il pellet per tre volte. Misurare la densità ottica a OD 600 ed utilizzare il 2% peso/volume di polivinilpirrolidone 40 o PVP 40 in PBS per diluire la sospensione batterica fino a un OD 600 pari a 0,3 o 1 × 10⁸ UFC per millilitro.
Per preparare l'inoculo di aminum, isolare diverse colonie singole dal ceppo M Meum M o E 11 che esprime stabilmente il vettore PS MT 3M cherry da Middlebrook sette H 10 aerato e inoculare 10 millilitri di brodo Middlebrook sette H nove contenente il 10% in volume per volume di Middlebrook A DC arricchito, integrato con 50 microgrammi per millilitro di igromicina; incubare tutta la notte a 28 gradi Celsius. Il giorno seguente, centrifugare un millilitro della coltura a 12.000 ×g per un minuto ed usare un millilitro di PBS sterile con lo 0,3% in volume per volume tra l'80 e il 90 per lavare il pellet per tre volte.
Misurare l'OD 600 della sospensione batterica e con PVP 40 al 2% peso per volume in PBS, diluito a un OD 600 di 0,3 o 0,3 per 10 alla otto UFC per millilitro, per ottenere le uova di pesce zebra. La notte prima del prelievo, posizionare un massimo di 50 femmine di pesce zebra nella camera inferiore di un contenitore per riproduzione di grandi dimensioni e 70 maschi nella parte superiore del contenitore. La mattina seguente, rimuovere il divisorio dal contenitore. Dopo circa un'ora, raccogliere le uova attraverso il collettore posto alla base del contenitore per la riproduzione in un tubo da 50 millilitri riempito con acqua per uova.
Dopo aver preparato le piastre per iniezione, secondo il protocollo testuale sul software operativo del microinjector automatico, fare clic su "calibra piatto", quindi selezionare la griglia da 10 24 pozzetti e posizionare la piastra aros nel microinjector; calibrare la piastra cliccando sullo schermo nella posizione centrale del pozzetto. Successivamente, accedere al menu dell'ago e fare clic su "calibra porta-ago".
Utilizzando una punta micro loader, riempire un ago da iniezione con diametro di 10 micron con 10 microlitri di PVP 40 contenente 100 UFC per nanolitro di S epiderm, 30 UFC per nanolitro di erum oppure con solo PVP 40 per iniezioni di controllo. Posizionare l'ago nell'iniettore micro automatico e calibrare la posizione XY abbassando o spostando verso l'alto l'ago e facendo clic sullo schermo nella posizione corrispondente all'ago. Successivamente, calibrare la posizione Z dell'ago facendo clic sullo schermo nella posizione della punta dell'ago. Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per distribuire le uova sulla griglia aros e rimuovere l'acqua in eccesso.
Quindi posizionare la griglia di agros riempita con uova nell'iniettore microautomatico nel menu di iniezione, regolare la pressione di iniezione a 200 hectopascal, il tempo di iniezione a 0,2 secondi e la pressione di compensazione a 15 hectopascal, valore che corrisponde a un nanolitro nel menu delle impostazioni del Femto jet. Cliccare su "inietta tutto" ed iniettare l'intera piastra di embrioni. Raccogliere le uova lavandole in una piastra di Petri e incubarle a 28 gradi Celsius.
Dopo aver configurato il citometro a flusso per particelle di grandi dimensioni, accedere al menu PMT e impostare il canale rosso a 650 volt e i canali verde e giallo a zero volt. Successivamente, nel menu delle soglie, impostare il segnale di soglia della densità ottica a 50, corrispondente a 975 millivolt, e il tempo minimo di volo a 800, corrispondente a 320 microsecondi. Per ridurre l'influenza dei detriti, posizionare gli embrioni nel bicchiere del campione e nel menu di selezione impostare il massimo di 70 embrioni per piastra da selezionare inserendo 70.
Posizionare una piastra di Petri vuota sotto il dispositivo di selezione e fare clic su selezione manuale. Quando la piastra di Petri è piena, salvare i dati cliccando su memorizza. Se è richiesta un'analisi o un'immagine ad alta risoluzione, gli embrioni possono essere selezionati singolarmente in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
Posizionare gli embrioni nella coppetta del campione e definire un massimo di un embrione per pozzetto da selezionare. Quindi posizionare una piastra 96 pozzetti vuota nel supporto piastra sinistro e fare clic su riempi piastra. Una volta riempita la piastra, salvare i dati cliccando su memorizza per analizzare gli embrioni trattati con farmaco a tre giorni dal trattamento con erum.
Trattare un gruppo di embrioni con un composto di interesse in un solvente e un secondo gruppo con il solo solvente. Posizionare gli embrioni trattati a quattro e cinque giorni post-fecondazione nella coppetta del campione sul citometro a flusso e impostare il sorteggio su 70 embrioni per piastra dopo aver anestetizzato gli embrioni in trica, e aver configurato il sistema automatico di screening per vertebrati e il campionatore di particelle grandi. Secondo il protocollo testuale del menu di configurazione del rilevamento degli oggetti nell'immagine, selezionare le immagini di riferimento corrispondenti all'età degli embrioni nel menu di archiviazione automatica delle immagini, selezionare il numero di immagini da acquisire e l'orientamento da utilizzare.
Posizionare una piastra a 96 pozzetti riempita con embrioni nel supporto di sinistra del campionatore per particelle grandi e fare clic su "esegui piastra". Quando un embrione è posizionato correttamente, utilizzare un obiettivo asciutto da 10x senza coprioggetto e acquisire separatamente le immagini della testa e della coda. Successivamente, utilizzare un software di elaborazione delle immagini per unire le immagini e valutare quale stadio di sviluppo sia più adatto per l'infezione del tuorlo.
Sono state eseguite iniezioni con dermitis e un marum in tutte le diverse fasi comprese tra lo stadio a una cellula e quello a 512 cellule. Come mostrato qui, le iniezioni con 100 UFC di dermitis effettuate tra lo stadio a 16 e quello a 128 cellule hanno fornito il miglior modello di infezione. I batteri si sono moltiplicati all'interno del tuorlo per tre giorni e si sono diffusi nel corpo a partire da tre giorni dopo l'infezione.
La quantificazione ad alto rendimento del carico batterico è stata eseguita mediante analisi dell'intensità di fluorescenza utilizzando un citometro a flusso per particelle di grandi dimensioni. Come mostrato qui, la quantità di batteri vivi presenti all'interno dell'embrione corrisponde molto bene al segnale fluorescente misurato. Questa figura dimostra che lo stadio di sviluppo ottimale per l'iniezione di 30 UFC di aminum è compreso tra lo stadio a 16 e 128 cellule per il ceppo E 11 e tra lo stadio a 16 e 64 cellule.
Con il ceppo EM più virulento, gli embrioni iniettati a questi stadi hanno mostrato una crescita batterica all'interno della quercia e una diffusione dei batteri attraverso l'embrione. Il trattamento pre-selezione di embrioni infettati da emerina con diverse concentrazioni di rifampicina ha mostrato una riduzione dell'infezione micobatterica in maniera dose-dipendente. L'uso del farmaco a una dose di 200 micromolare ha dimostrato che esso blocca efficacemente la progressione batterica di M. mein E 11, 24 ore e oltre dopo il trattamento, una volta completato lo sviluppo.
Queste tecniche hanno aperto la strada ai ricercatori nel campo del collaudo dei composti e dello sviluppo di farmaci, alla ricerca di nuovi trattamenti per malattie infettive come la tubercolosi o infezioni associate a biomateriali.
Panoramica
Questo articolo video descrive una procedura ad alto rendimento sviluppata per infettare e analizzare un elevato numero di embrioni di pesce zebra, fornendo uno strumento potente per la sperimentazione di composti e la scoperta di farmaci.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Scoperta di farmaci
- Biologia delle infezioni
Sfondo
- Gli embrioni di zebrafish sono utilizzati come organismo modello per lo studio delle infezioni.
- Metodi ad alto rendimento consentono l'analisi di grandi dimensioni campionarie.
- Tecniche automatizzate migliorano l'efficienza e la riproducibilità negli esperimenti.
- La sperimentazione farmacologica su embrioni infetti può rivelare l'efficacia dei composti.
Scopo dello studio
- Generare un elevato numero di embrioni di pesce zebra infetti da sottoporre a test.
- Analizzare gli effetti di composti su infezioni batteriche.
- Potenziare i processi di scoperta di farmaci utilizzando un modello vertebrale.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un contenitore di allevamento di grandi dimensioni per il prelievo sincrono di uova.
- Microiniezione automatizzata di batteri nel tuorlo del pesce zebra.
- Citometria a flusso per particelle di grandi dimensioni per il sorting degli embrioni.
- Microscopia confocale per l'analisi ad alta risoluzione delle infezioni.
Risultati principali
- L'infezione riuscita degli embrioni consente un'analisi ad alto rendimento.
- I metodi automatizzati producono embrioni uniformemente colpiti.
- Gli effetti del trattamento farmacologico possono essere valutati quantitativamente.
- L'immagine ad alta risoluzione rivela interazioni dettagliate tra composti e infezioni.
Conclusioni
- La procedura consolidata migliora in modo significativo gli sforzi nella scoperta di farmaci.
- Le tecniche automatizzate forniscono risultati affidabili e riproducibili.
- Questo metodo può essere adattato a diversi scenari di test dei composti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello di infezione ad alto rendimento nel pesce zebra colma il divario tra saggi basati su cellule e la validazione in vivo nei mammiferi, consentendo lo screening di composti nelle fasi iniziali con rilevanza fisiologica nell'intero organismo. Generando un elevato numero di embrioni infettati in modo sincrono, il metodo fornisce una maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi e riduce l'insuccesso nelle fasi avanzate dei percorsi di scoperta di farmaci anti-infettivi. Il flusso di lavoro scalabile accoglie diversi patogeni batterici e librerie di composti, migliorando la continuità traslazionale dall'identificazione dei composti attivi alla valutazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in un contesto di infezione su animale intero, chiarificando le interazioni tra patogeno e ospite e l'essenzialità dei bersagli.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante modelli di infezione omogenei e sincronizzati, che riducono la variabilità nei risultati dello screening fenotipico.
- Valore predittivo: Facilita decisioni precoci di tipo go/no-go quantificando gli effetti del composto sul carico batterico in vivo, migliorando l'efficienza nel triage del portafoglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per la preparazione di sistemi biologici validati, adatti alla successiva valutazione di composti.
- Valore operativo: Utilizza microiniezione automatizzata e citometria a flusso per particelle di grandi dimensioni per garantire coerenza del saggio, scalabilità e elevata capacità di elaborazione dei campioni.
- Prontezza per lo screening: Genera letture quantitative basate sulla fluorescenza del carico batterico, consentendo analisi dose-risposta affidabili e conferma dei risultati positivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Mantiene la rilevanza per le malattie modellando infezioni da Staphylococcus epidermidis e Mycobacterium marinum, che rispecchiano patologie associate a biomateriali e correlate alla tubercolosi.
- Allineamento preclinico: Supporta decisioni di avanzamento con valutazione del rischio collegando segnali precoci di efficacia a meccanismi antimicrobici noti, come l'inibizione dipendente dalla dose di rifampicina.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Consente l'uso di linee di zebrafish transgenici per decifrare il meccanismo d'azione del composto, rafforzando la fiducia sul bersaglio prima degli studi nei mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto attivo fino alla sperimentazione preclinica dell'efficacia, in particolare per programmi anti-infettivi che richiedono una validazione su animali interi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'infezione e dell'interferenza dei composti in un ospite vertebrato.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso l'allineamento automatizzato degli embrioni, l'iniezione precisa nel tuorlo e il presorting mediante citometria a flusso, per assicurare condizioni iniziali uniformi.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative delle variabili dipendenti tramite l'analisi dell'intensità di fluorescenza, consentendo un confronto oggettivo del carico batterico tra i diversi gruppi di trattamento.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica attraverso il profilo dose-risposta di antibiotici noti, stabilendo biomarcatori predittivi dell'efficacia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per lo screening di diverse librerie di composti contro multipli patogeni, riducendo la dipendenza dallo sviluppo di saggi su misura.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione del target riducendo l'ambiguità meccanicistica attraverso l'osservazione diretta della modulazione dell'infezione in vivo.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità grazie a flussi di lavoro automatizzati e alla produzione sincronizzata di embrioni.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione, l'efficienza del capitale e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei programmi anti-infettivi.
- Impatto sul portafoglio: Consente decisioni di priorità e avanzamento corrette per il rischio basate su dati quantitativi di efficacia in vivo derivanti da schermate ad alta produttività.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allevamento di zebrafish, nelle tecniche di microiniezione e nell'uso della citometria a flusso.
- Dipende da microiniettori automatici, citometri a flusso per particelle grandi e sistemi di rilevamento della fluorescenza.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di infezione, la preparazione dei composti e le procedure di analisi dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse ceppi batterici, linee transgeniche e letture dell'infezione in base alla virulenza del patogeno e alla risposta dell'ospite.
- I limiti pratici includono i vincoli sulla vitalità degli embrioni dopo l'infezione e la necessità di ottimizzare i titoli dell'inoculo batterico per garantire una penetrazione costante del fenotipo.
