Multi-elettrodi array registrazioni di umano Epileptic postoperatoria corticale del tessuto

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire registrazioni multi-elettrodo di eventi ex vivo, interictali e simili a convulsioni dal tessuto corticale epilettico umano, fornendo così un modo per affrontare i meccanismi di base alla base delle attività epilettiche, l'inizio, la propagazione e gli effetti dei farmaci antiepilettici sia a livello cellulare che di rete. Ciò si ottiene in primo luogo, resecando attentamente il tessuto corticale umano da pazienti con epilessia farmacoresistente durante l'intervento chirurgico. Il secondo passo consiste nel rimuovere i coaguli di sangue, i vasi e le meningi e la sostanza bianca in eccesso prima di affettare.

Quindi, tagliare il blocco di tessuto in fette da 400 micron. Il passaggio finale consiste nel mantenere le fette nelle condizioni di interfaccia di elevata ossigenazione e temperatura controllata con lenta perfusione. In definitiva, la tecnica dell'array multi-elettrodo viene utilizzata per registrare l'attività interictale spontanea e gli eventi ictali evocati.

Il nostro laboratorio indaga il ruolo delle interazioni neurogliali nella fisiopatologia cerebrale per studiare come le cellule neurali possono generare attività di rete patologica nell'uomo. Recentemente abbiamo stabilito registrazioni multi electrode array di tessuto corticale epilettico umano postoperatorio in collaborazione con gli ospedali per la cura del collo e per la cura del grembo. Oggi, Thomas Blo, neurochirurgo del Neck Care Hospital, insieme a Feld, epilettologo e ricercatore presso il Lapis Hospital e Elena DOI, postdoc nel mio laboratorio, vi mostreranno come eseguire e fare buon uso di tali tecniche.

Dalla raccolta del tessuto epilettico umano alle registrazioni MEA ex vivo, l'uso dell'ECT del tessuto corticale umano per curare i pazienti epilettici consente l'esplorazione diretta dei neuroni epilettici umani funzionalmente mantenuti e delle cellule gliali, che sono interconnessi in reti specifiche. Le indagini in vitro su un tessuto umano danno accesso a singole cellule e attività di rete, meccanismi basati su ioni, che non possono essere completamente affrontati in vivo. La registrazione MEA del tessuto corticale umano può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo dell'epilessia, come i meccanismi cellulari alla base dell'esogenesi e della propagazione delle convulsioni.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'epilessia lesionale e alla loro terapia perché permette di comprendere i meccanismi della farmacoresistenza e l'effetto del farmaco antiepilettico sugli eventi convulsivi registrati nelle fette corticali umane. In vitro. Il vantaggio principale dei multi electro array rispetto ai metodi esistenti come e, e, g o micro elettrodi in vivo, è che consentono la stimolazione e la registrazione simultanea e non invasiva dei potenziali di campo e dell'attività multiunità da diversi lati del tessuto.

Per iniziare la procedura, preparare la camera di interfaccia riempiendo prima la sezione inferiore con acqua distillata. Quindi collegare la camera a una fonte di carbogena. Quindi, tagliare un pezzo di tessuto per lenti in modo che si adatti all'area piatta della camera a fette.

Posizionarlo accanto al tubo di ingresso per consentire alle bolle di fuoriuscire dalla linea di ingresso prima di raggiungere le fette. Dopodiché, taglia due pezzi di filo di cotone intrecciato della stessa lunghezza del pezzo di tessuto per lenti. Posizionarli ai lati dell'area piana della camera, impostare la portata della pompa peristaltica su un millilitro al minuto.

Successivamente attivare l'ossigenazione dell'acqua nella parte inferiore della camera. Quindi impostare il regolatore di temperatura su 37 gradi Celsius. Coprire la parte superiore della camera di interfaccia con un pezzo di paraforma e attendere almeno 30 minuti affinché la temperatura aumenti e si stabilizzi.

Ora, prepara gli strumenti di dissezione, che includono due pinze sottili, una spatola, un cucchiaino e una lama, due piastre di Petri di vetro, due pennelli e la colla cianoacrilica. Successivamente, prepara il vibrato impostando i parametri per l'affettatura. In questa procedura, rimuovere il CSF a base di saccarosio preparato dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e schiacciarlo in granita.

Ossigenarlo con carbogeno. Quindi trasferire 250 millilitri di granita A CSF in una bottiglia di vetro e conservarla in una bottiglia riempita di ghiaccio per la raccolta dei tessuti in sala operatoria. In anestesia generale standard, utilizzare un sistema di neuronavigazione per consentire una localizzazione precisa della corteccia.

Successivamente, praticare un'incisione nella pelle, quindi creare un foro per la fresa nell'osso, seguito da una craniotomia. Quindi, sollevare delicatamente il lembo osseo e aprire la dura madre con le forbici. Successivamente eseguire la resezione a blocchi della corteccia epilettica ed evitare una coagulazione estesa.

Tagliare un blocco corticale dello spessore di un centimetro e inserirlo nel saccarosio ossigenato congelato a base di A CSF. Successivamente, trasferire il tessuto in saccarosio congelato a base di A CSF in laboratorio il più velocemente possibile, ma evitando shock meccanici. Ora, riempi una capsula di Petri e il vassoio del tampone vibrato con la granita A CSF ossigenata a base di saccarosio e continua a ossigenare la granita A CSF con carbogen.

Quindi estrarre con cautela il fazzoletto dalla bottiglia con un cucchiaio e metterlo nella capsula di Petri. Usando il forcipe, rimuovere con cura i coaguli di sangue, i vasi sanguigni e le meningi per evitare resistenza durante l'affettatura. Tagliare il lato del tessuto con una lama per ottenere una superficie piana il più parallela possibile al lato opposto del tessuto.

Quindi incollare il tessuto sulla piastra del campione di vibrato per preparare fette corticali trasversali. Successivamente, posizionarlo nella vaschetta tampone e tagliare a bassa velocità fette spesse 400 micron. Quindi, taglia alcuni pezzi di tessuto per lenti con una spatola e un pennello.

Trasferire queste fette di tessuto del cristallino nella camera di interfaccia. Incubarli a 37 gradi Celsius per almeno un'ora prima di registrare. In questa procedura, collegare il sistema di perfusione a una pompa peristaltica e il sistema MEA a un computer.

Quindi posizionare un chip MEA vuoto all'interno dell'amplificatore. Quindi, impostare il regolatore di temperatura per il riscaldamento dell'elemento della cannula nella camera MEA a 37 gradi Celsius. Iniziare la perfusione dell'A CSF ossigenato a cinque o sei millilitri al minuto.

Successivamente, apri il software di registrazione. Assicurarsi che tutti gli elettrodi MEA siano ben collegati e che non ci siano rumori dovuti alla perfusione. Ora versa un po' di A CSF riscaldato in una capsula di Petri di vetro.

Trasferire una fetta dalla camera di interfaccia alla piastra di Petri afferrando il tessuto del cristallino. Staccare quindi con cura la fetta dal fazzoletto immergendola nella soluzione, oppure utilizzare un pennellino per facilitare il distacco. Quindi, riempi il chip MEA con un po' di A CSF.

Trasferire la fetta sul chip MEA con una spatola con una pipetta di plastica. Rimuovere delicatamente la soluzione per far aderire la fetta all'area dell'elettrodo e tenerla in posizione con un'ancora di platino. Successivamente, aggiungi un millilitro di registrazione di un CSF al chip MEA e posizionalo nell'amplificatore.

Quindi iniziare la perfusione a cinque o sei millilitri al minuto. Quindi, controllare la posizione della fetta nell'area di registrazione MEA. Utilizzando il software del monitor MEA, regolarlo se necessario.

Per registrare dagli strati corticali e scattare una foto, avviare la registrazione. Questa è una traccia rappresentativa dell'attività della fetta corticale umana registrata da un elettrodo MEA. Nel liquido cerebrospinale A normale, è possibile osservare un'attività spontanea di tipo interictale 15 minuti dopo la perfusione con il liquido cerebrospinale di potassio A da sei millimolari privo di magnesio.

La prima crisi epilettica compare ed è seguita da altri eventi a intervalli di due o tre minuti. La traccia blu illustra l'attività ingrandita. Questo pannello mostra i dati passa-alto filtrati a 250 hertz, che rivelano l'attività di più unità quando ingranditi, ecco una registrazione rappresentativa di un sequestro da tutti gli elettrodi MEA privi di magnesio.

Sei millimolari di potassio A CSF. Ogni quadrato rappresenta un elettrodo di 12 per 12 MEA e mostra un'82a finestra temporale. La linea tratteggiata indica la posizione della superficie corticale rispetto all'array MEA.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasportare in sicurezza il tessuto corticale umano, preparare e conservare la psoriasi corticale vitale ed eseguire registrazioni MEA delle attività epilettiche spontanee e indotte Durante il tentativo di questa procedura, è importante avere una stretta collaborazione tra il team clinico in ospedale e i ricercatori in laboratorio. Non dimenticare mai che lavorare con i tessuti umani può essere pericoloso e che è necessario proteggersi sempre, come indossare guanti per evitare possibili malattie infettive Dopo questa procedura. Altre tecniche come l'imaging a fluorescenza, la lampada patch, la registrazione, lo smistamento degli spike e l'analisi istologica possono essere accoppiate alle registrazioni EM EA per correlare le proprietà sinaptiche, il comportamento delle singole cellule, la dinamica ionica e le anomalie cellulari e molecolari alle attività della popolazione.

L'esecuzione di registrazioni MEA di tessuti epilettici umani può aprire la strada ai ricercatori per esplorare le epilessie lesionali al fine di chiarire i meccanismi alla base dell'esogenesi e della farmacoresistenza, nonché il ruolo dell'interazione neurogliale in questo fenomeno. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il tuo esperimento.