L'induzione di proteine ​​Cancellazione Through In Utero Elettroporazione per definire deficit in migrazione neuronale in modelli transgenici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di analizzare i difetti nello sviluppo neurale e nella migrazione in modelli murini transgenici utilizzando l'elettroporazione in utero di varie regioni del proencefalo embrionale. Ciò si ottiene iniettando un plasmide che trasporta i geni per Cree e una proteina reporter come la GFP nel ventricolo di un cervello embrionale e applicando una corrente elettrica alla testa per attirare quel plasmide nel rivestimento cellulare del ventricolo. In una seconda fase, gli embrioni vengono restituiti alla cavità addominale della madre per consentire agli embrioni di continuare a svilupparsi, mentre la piega esprime e media l'escissione genica in particolare nei neuroni elettroporati.

Successivamente, gli embrioni vengono raccolti e i cervelli vengono fissati per l'analisi al fine di determinare l'effetto dell'escissione genica mediata da CRE e il successivo knockdown delle proteine nei neuroni elettroporati: si ottengono risultati che mostrano come l'escissione del gene di interesse regola lo sviluppo neurale e la migrazione in modo specifico per la cellula, utilizzando l'immunoistochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come le linee CRE transgeniche tessuto-specifiche, è che l'elettroporazione di Cree asporta il gene di interesse solo da una piccola popolazione di neuroni in una regione del cervello scelta dal ricercatore, questo semplifica notevolmente i risultati e facilita l'analisi del fenotipo. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale perché le fasi chirurgiche possono essere molto difficili da imparare e gli embrioni in questa fase sono molto delicati e facili da danneggiare inavvertitamente.

Prima dell'intervento chirurgico, diluire un singolo plasmide a due microgrammi per microlitro in acqua sterile con un microlitro di colorante verde veloce allo 0,1% in peso per volume per 10 o 20 microlitri di soluzione plasmidica diluita. Quindi, tirare le provette microcapillari in vetro su una micropipetta polare standard a una singola fase di 62 gradi Celsius. Quindi utilizzare le punte delle pipette del micro caricatore per caricare gli aghi estratti con la soluzione plasmidica.

Non riempire completamente la punta dell'ago, poiché ciò causerebbe l'ostruzione dell'ago. In questa procedura, praticare un'incisione nella pelle sopra l'addome tra i tets inferiori di un topo gravido anestetizzato. Allontanare la pelle dallo strato muscolare sottostante strappando il tessuto connettivo.

Quindi tagliare il peritoneo nella cavità addominale lungo il gomito lineare. Inserire il divaricatore della ferita per separare i bordi. Quindi rimuovere l'utero dalla cavità addominale e stenderlo come mostrato.

Se diversi cuccioli devono essere iniettati con plasmidi diversi, conta i cuccioli su ciascun lato e decidi quali e quanti iniettare con ogni plasmide restituiscono un lato dell'utero nell'addome per mantenere gli embrioni caldi e lubrificati inumidisci immediatamente l'utero esposto con soluzione salina calda. Quindi, inserire un ago carico nella testa dell'impugnatura della bacchetta di iniezione. Tagliare con cura la punta con un paio di piccole forbici chirurgiche o pinze sottili in modo tale che l'ago rimanga il più a lungo possibile pur consentendo il passaggio del fluido.

Quindi regolare la lunghezza dell'iniezione e la pressione di iniezione sul microiniettore in modo che sulla punta dell'ago appaia una goccia piccola ma facilmente visibile da 0,1 a 0,2 microlitri. Quando si preme la paletta del piede, mantenere il volume di questa gocciolina il più costante possibile tra i diversi aghi. Ora seleziona un embrione e posizionalo delicatamente sulla schiena con la testa inclinata verso l'alto.

Una volta che l'embrione è in posizione, individua il ventricolo, che si presenta come un'ombra a forma di mezzaluna parallela al seno sagittale. Toccare l'utero sopra il ventricolo con una leggera angolazione con la punta dell'ago e guidare l'ago attraverso la parete uterina. Quindi spingere l'ago attraverso la corteccia nel ventricolo.

Quindi, pompare la paletta del piede per iniettare la soluzione plasmidica. Continuare a pompare fino a quando un'area verde è visibile e si adatta alla forma dell'arco del ventricolo. Nei giovani embrioni, il colorante si diffonde spesso nel ventricolo controlaterale.

Iniettare circa tre o quattro embrioni in tutto e mantenere tutti gli embrioni esposti umidi con soluzione salina durante la procedura. A partire dal primo embrione iniettato, posizionare le piastre in modo tale che l'elettrodo positivo attiri il plasmide nella regione desiderata del cervello. Inclinare l'elettrodo negativo in modo che il percorso più breve tra gli elettrodi passi direttamente attraverso la struttura destinata all'elettroporazione.

Una volta posizionate le palette, applicare l'ammortizzatore. A seconda dell'età e delle dimensioni degli embrioni, utilizzare cinque impulsi da 35 a 50 volt, una lunghezza dell'impulso di cinque millisecondi e un intervallo di impulsi di 950 millisecondi. Per l'elettroporazione, ripetere con tutti gli embrioni iniettati.

Successivamente, riporta entrambi i lati dell'utero al topo. Fare attenzione a mantenere la superficie umida con soluzione fisiologica e a non applicare troppa pressione per prevenire traumi al sax amniotico. Quindi, sutura lo strato muscolare usando un semplice punto continuo.

Quindi pinzare la pelle chiusa. Ora prepara quattro gradi Celsius filtrati al 4% di PFA. Dopo l'eutanasia dell'animale con un'iniezione intraperitoneale di una dose letale di pentobarbital sodico, tagliare l'addome.

Quindi estrarre entrambi i lati dell'utero e distenderli come quando i cuccioli sono stati inizialmente iniettati. Se i cuccioli sono stati iniettati con plasmidi diversi, assicurati di localizzare ogni cucciolo notando eventuali cuccioli morti e determinare quali sono stati iniettati con plasmidi di controllo e sperimentali. Prima di rimuovere l'utero dalla femmina, rimuovere ogni cucciolo dall'utero e dal sacco amniotico individualmente.

Decapita con forbici affilate o una lama di rasoio e posiziona la testa in PBS. Nel caso di topi transgenici, raccogliere campioni di tessuto per la genotipizzazione e tenere ogni testa separata, ad esempio in una piastra a 12 pozzetti sotto un cannocchiale da dissezione, rimuovere il cervello dal cranio, il tutto facendo attenzione a non intaccare la corteccia o strappare la linea mediana. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, controlla se il cervello ha una patch positiva alla GFP che indica che sono stati elettroporati con successo.

Successivamente, fissa il cervello in PFA a quattro gradi Celsius durante la notte. Ora, scaldare l'acido citrico dove il pH era precedentemente impostato a sei in una camera di colorazione in un forno a microonde o a bagnomaria fino a raggiungere i 75-80 gradi Celsius. Quindi mettere i vetrini nella camera di colorazione per 10-15 minuti.

Successivamente, lavare i vetrini in PB S3 volte per tre minuti ogni volta a temperatura ambiente. Applicare l'anticorpo primario e procedere con l'immunocolorazione secondo un protocollo standard. Quindi convalidare l'escissione mediata da CRE mediante co-marcatura per GFP e il gene di interesse per confermare il knockdown.

Questa figura mostra la conferma dell'escissione mediata da CRE mediante colorazione cos per un bersaglio a valle del gene deleto. RB floccato, P 1 0 7 knockout P uno 30 embrioni floccati sono stati elettroporati con il plasmide PCI due vuoto o con il plasmide PCI due Cree e colorati per GFP e KI 67. Un marcatore della proliferazione cellulare.

Cellule doppiamente colorate sono state osservate nei neuroni, elettroporate con Cree, ma non nei neuroni. Elettroporata con psig. Due da soli.

L'escissione di RB è stata confermata anche eseguendo PCR con primer di genotipizzazione sul DNA estratto dalle sezioni di tessuto rimosse dai vetrini. La banda superiore rappresenta l'allele F flox e la banda inferiore rappresenta l'allele di tipo selvatico. La freccia indica l'allele asportato nel lato elettroporato del cervello.

Solo l'escissione mediata da CRE può essere confermata anche in vitro utilizzando plasmidi con codoni di stop floccati. A monte di RFP come NL DS Red RFP è espresso solo nelle cellule EK quando cot trasfettato con Cree GFP in cellule HEK 2 93, indicando che l'escissione è andata a buon fine Seguendo questa tecnica. Altri metodi come la coltura cellulare, l'immunoistochimica o l'elettrofisiologia possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande riguardanti lo sviluppo e la funzione dei singoli neuroni dopo l'escissione genica c mediata.

Dopo aver osservato questa tecnica, si può vedere come l'elettroporazione in utero possa essere utilizzata per colpire le diverse regioni del cervello, e questo può davvero aiutare a capire alcuni di quei fenotipi complessi che abbiamo con diversi animali transgenici.