Valutazione della solidità del grasso umano iniezione in topi nudi con Micro-Tomografia Computerizzata

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere un modello murino che utilizza la micro CT per confrontare la ritenzione del volume tra le tecniche di differimento della preparazione e della somministrazione dell'innesto di grasso. Ciò si ottiene elaborando prima il lipoaspirato umano per ottenere grasso pronto per l'innesto. Il secondo passo consiste nel posizionare innesti di grasso nel cuoio capelluto di topi nudi al timo CD one.

Successivamente, la sopravvivenza dell'innesto di grasso viene analizzata settimanalmente mediante topi con scansione TC, ricostruendo le immagini e quantificando la ritenzione di volume. Il passo finale consiste nell'esporre l'innesto di grasso alla fine di otto settimane e confrontarli in base al peso e all'istologia. In definitiva, la microTC e l'istologia vengono utilizzate per mostrare le differenze nella qualità e nella sopravvivenza dell'innesto di grasso.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la pesatura degli innesti di grasso, è che consente di visualizzare e quantificare oggettivamente il volume dell'innesto di grasso in più punti temporali dopo l'innesto iniziale senza dover sacrificare l'animale di studio. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a utilizzare la micro CT per analizzare i difetti della calva. Le implicazioni di questa tecnica sono che offre un modello chirurgico per tutti gli studi che valutano l'innesto, la ritenzione e la vitalità del grasso.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché contenere l'innesto di grasso nella posizione corretta sopra il cuoio capelluto è difficile. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale in quanto le fasi di innesto e ricostruzione sono difficili da apprendere perché ci sono numerose fasi in cui una piccola deviazione nella tecnica può alterare il risultato. Utilizzando la procedura di Coleman, ottenere tessuto adiposo umano dalle regioni dell'addome, del fianco e della coscia di pazienti sane sottoposte a liposuzione elettiva.

Per elaborare il lipo aspirato per l'innesto, iniziare lasciando riposare il grasso per 30 minuti. L'aspirato lipo si deposita tipicamente in tre strati con olio nella parte superiore, grasso nel mezzo e sangue nella parte inferiore. Aspirare e scartare lo strato di olio superiore seguito dallo strato di sangue inferiore.

Per rimuovere ulteriormente il liquido tumescente rimanente o i detriti cellulari, centrifugare il grasso per cinque minuti a 350 g e quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aspirare lo strato inferiore di sangue e procedere con lo strato superiore di olio. Per calcolare la quantità di grasso necessaria per l'innesto come descritto nel protocollo di testo, per eseguire l'innesto di grasso, ottenere topi nudi femmina omozigoti CD one.

Per lo studio sperimentale, scegliere topi di età compresa tra le otto e le 12 settimane per indurre l'anestesia. Metti il mouse in una scatola di smontaggio con una miscela di fluoro ossigeno al 2,5% a due litri al minuto per circa 10 minuti quando la frequenza respiratoria del topo è rallentata. Confermare un'adeguata sedazione con un pizzico di punta.

Applicare un unguento oftalmico lubrificante veterinario su entrambi gli occhi del topo e posizionare il naso del topo in un cono nasale, erogando una miscela di ossigeno fluoro ISO al 2,5% a uno o due litri al minuto. Quindi, imposta un campo sterile sotto il mouse. Quindi sterilizzare un cuoio capelluto con iodio povidone al 2,5%, seguito da una soluzione di etanolo al 70%.

Ripetere la sterilizzazione altre due volte. Caricare una siringa lure lock da un millilitro con un millilitro di grasso che è stato bilanciato a temperatura ambiente. Collegare una cannula per innesto di grasso lunga otto centimetri calibro 14 all'estremità della siringa.

Adescare il sistema premendo lo stantuffo della siringa fino a quando nella siringa rimangono tra i 200 e i 400 microlitri di grasso. Mentre si preme lo stantuffo della siringa, verificare che la cannula sia completamente piena di grasso osservando il grasso che esce dal foro della cannula distale utilizzando una pinza fine. Sollevare la pelle dorsale nella linea mediana sovrastante l'aspetto più grande del cranio della coccola.

Fai un taglio di 1,5 millimetri nella pelle usando le forbici sottili. Posiziona una sutura di nylon da sei oh attraverso il centro del taglio che verrà successivamente utilizzata per unire i bordi della ferita. Dopo aver eseguito l'innesto, non legare la sutura.

Quindi creare una tasca sottocutanea sopra il cranio inserendo la cannula attraverso l'incisione cutanea e passando la cannula avanti e indietro in uno schema a forma di ventaglio sopra il cranio per liberare eventuali attacchi di tessuto connettivo alla pelle sovrastante in una volta che la tasca è stata creata, posizionare la cannula nella linea mediana del topo direttamente sopra il cranio fino a quando la punta si trova all'aspetto theramos della tasca, che dovrebbe essere appena dietro una linea tracciata tra gli occhi. Iniettare lentamente il grasso in modo retrogrado, facendo avanzare lo stantuffo mentre si tira indietro la cannula. Usando una pinza, unisci i bordi della ferita e sollevali per evitare che il grasso fuoriesca dalla tasca.

Legare la sutura precedentemente posizionata, assicurandosi che il primo nodo poggi leggermente contro la pelle. Fai altri tre nodi quadrati e taglia la sutura con una coda di tre millimetri. Rimuovere il mouse dall'anestesia e procedere con il recupero come dettagliato nel protocollo di testo.

Prima di eseguire la prima scansione, calibrare la micro CT con un fantoccio di imaging che distingua tra aria, acqua e intensità ossea. Dopo la calibrazione. Posizionare quattro mouse nello scanner in posizione ventrale con due mouse in alto e due in basso.

Posizionare su un letto di scansione. Precedentemente costruito con siringhe da 60 millilitri per contenere il corpo del topo e siringhe da 10 millilitri come coni nasali. Confermare con un'immagine scout che verrà ripreso l'intero cranio del topo, dal naso alla prima vertebra cervicale e dalla parte superiore del cranio alla base del cranio.

Continuare con la scansione come descritto nel protocollo di testo. Apri le immagini ricostruite con un software di analisi di imaging micro CT che consente la creazione di regioni di interesse o ROI selezionando i voxel utilizzando le soglie per l'intensità dei pixel. Inizia caricando le immagini TC ricostruite in viste bidimensionali, coronali, assiali e sagittali.

Utilizzando la fetta assiale come guida, navigare fino alla fetta sagittale che corrisponde all'aspetto più a sinistra dell'innesto di grasso. Selezionare una soglia superiore e inferiore per l'intensità dei pixel che catturi tutti i voxel corrispondenti all'innesto di grasso, ma che escluda il tessuto e l'osso circostanti. Definisci un ROI nella vista sagittale che corrisponda all'innesto di grasso.

Utilizzando le soglie di intensità dei pixel precedentemente definite, ripetere questa procedura ogni cinque fette sagittali navigando fino a raggiungere l'aspetto più destro dell'innesto. Successivamente, interpolare i voxel selezionati da tutte le ROI 2D in un'unica ROI 3D combinata, registrare il volume ROI calcolato dal software. Renderizza l'isosuperficie 3D per visualizzare il volume finale dell'innesto di grasso.

Nell'analisi successiva, assicurarsi di mantenere i valori di soglia massima e minima dell'intensità dei pixel uguali a quelli utilizzati per l'analisi di base dopo che i topi sono stati sottoposti a scansione per l'ottava settimana. Eutanasia dei topi come descritto nel protocollo di testo. Posizionare il mouse nel campo operatorio utilizzando le forbici per tenotomia, aprire con cautela la tasca e la pelle sovrastante e gli attacchi del tessuto connettivo dall'innesto di grasso.

A questo punto, può essere utile asportare una macchia della pelle dorsale sovrastante per facilitare l'estrazione dell'innesto. Rimanere il più vicino possibile all'innesto durante l'assalita per ridurre al minimo il tessuto connettivo prelevato dall'innesto dopo l'asportazione dell'innesto. Misurare la massa su una scala a strappo con una precisione di almeno 0,01 grammi.

Gli innesti di grasso sono progressivamente diminuiti di volume nel corso dello studio, con una sopravvivenza media del 62,2% entro l'ottava settimana. Al termine dell'ottava settimana, ogni innesto di grasso è stato estratto in un unico pezzo. Un test della somma dei ranghi di coxin WIL è stato utilizzato per confrontare la differenza tra le misurazioni del volume dell'innesto di grasso ottenute mediante micro CT o calcolate dalla massa fisica.

Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra questi due metodi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore per sessione se eseguita correttamente. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di eseguire gli interventi chirurgici e le ricostruzioni allo stesso modo ogni volta che si segue questa procedura.

Altri metodi, come l'immunocolorazione e il Q-R-T-P-C-R, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui la vascolarizzazione e l'espressione genica sono influenzate da diversi metodi di innesto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare l'aspirato lipo per l'innesto di innesti di scansione TC seriale in vivo, valutare la sopravvivenza dell'innesto e spiegare gli innesti per l'istologia del peso e l'analisi futura dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della chirurgia plastica per esplorare l'innesto di grasso nel modello speculare.