Name: Modulazioni ambientali del numero di Mesencefalo dopamina neuroni in topi adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Scopri come manipolazioni ambientali e arricchimento influenzano la neuroplasticità nel mesencefalo di topi adulti. Questo metodo permette di studiare i neuroni dopaminergici e i meccanismi sinaptici GABAergici.

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Questo studio è stato supportato dal National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Project grant 1022839. AJH è un FT3 Future Fellow (FT100100835) dell'Australian Research Council (ARC). Il Florey Institute of Neuroscience and Mental Health riconosce il sostegno della sovvenzione per il sostegno alle infrastrutture operative del governo del Victoria.

NOTA: Tutte le procedure sperimentali su animali sono stati approvati dall&#39;Istituto Florey di Neuroscienze e Salute mentale Comitato etico degli animali e sono conformi alle Australia National Health e Medical Research Council ha pubblicato il codice di condotta per la cura e l&#39;uso di animali a fini scientifici (7 ° edizione, 2004). 1. manipolazioni ambientali <ol><li> Genere Pairing <ol><li> Utilizzare sessualmente maturi (&gt; 8 settimane di età), di sesso maschile di pari età e topi femmina. NOTA: Noi di solito utilizzare C57BL / 6 topi, ma abbiamo avuto gli stessi risultati utilizzando topi svizzero in questo protocollo. Usiamo tipicamente n = 8 maschi e n = 8 femmine per ogni esperimento, diviso in n = 2 coppie maschio-maschio (n = 4 maschi), n = 2 coppie femmina-femmina (n = 4 femmine), e n = 4 coppie maschio-femmina (n = 4 maschi e n = 4 femmine). </li><li> All&#39;arrivo nella struttura detenzione degli animali, il gruppo-casa i topi di genere per&gt; 3 giorni di tempo per acclimatarsi. Qui e througHout l&#39;abbinamento genere, mantenere stimoli ambientali estranei (ad esempio la temperatura ambiente, la luce: il ciclo scuro, cibo, acqua, gestione e pulizia) costante o distribuire equamente a tutti i topi. </li><li> Assegna in modo casuale ogni mouse a una coppia maschio-maschio, un paio femmina-femmina, o un paio maschio-femmina. Mettere ogni coppia in una gabbia pulita in isolamento (2 topi / gabbia) con ad libitum l&#39;accesso al cibo e all&#39;acqua, e semplicemente alloggiare in questo modo continuo per 7 giorni. NOTA: routine zootecnia è OK in questo periodo, ma deve essere distribuito equamente a tutti i topi. Fare attenzione ad evitare l&#39;accoppiamento di fratellini maschili e femminili. </li></ol></li><li> Arricchimento ambientale <ol><li> Utilizzare sessualmente maturi (&gt; 8 settimane di età), maschio o femmina topi di pari età. NOTA: Usiamo tipicamente n = 18 topi per ogni esperimento, divisi in gruppo n = 6 / trattamento. </li><li> All&#39;arrivo nella struttura detenzione animale tenerli ospitato gruppo ospitato in serie identiche (SH) (ad esempio, </em&gt; Vedi sotto) le condizioni in questa fase per&gt; 3 giorni di tempo per acclimatarsi. Qui e in tutto l&#39;esperimento, mantenere stimoli ambientali estranei (ad esempio la temperatura ambiente, la luce: il ciclo scuro, cibo, acqua, gestione e pulizia) costante o distribuire equamente a tutti i topi. </li><li> Per iniziare l&#39;arricchimento ambientale, assegnare casualmente ogni mouse a uno dei 3 gruppi: SH; ruote in esecuzione (RW), o l&#39;ambiente arricchito (EE) e porre ogni gruppo di topi insieme in una gabbia pulita identico ad libitum accesso al cibo e all&#39;acqua. NOTA: Qui, gabbie più grandi-ratto in possesso di tutti i gruppi, di 27 cm di larghezza, 42 cm e 16 cm di profondità sono stati utilizzati. <ol><li> Inoltre, fornire le seguenti condizioni ambientali per ciascun gruppo: SH che comprende solo cucciolata (pellet di carta o segatura) al piano; RW comprendente SH più 2 in esecuzione ruote; EE comprendente RW più giocattoli (corde, scale, tunnel, e oggetti, quali panini e pezzi di carta velina tovagliolo di carta vuoto) con la quale a explore, giocare, arrampicarsi, nascondersi, e nido. </li><li> Loro casa in questo modo continuo per 14 giorni. NOTA: routine zootecnia è OK in questo periodo, ma deve essere distribuito equamente a tutti i topi. </li></ol></li><li> Oggetto topi EE a ulteriori &#39;super-arricchimento&#39; (SE) per metterli insieme in una gabbia più grande contenente nuovi giocattoli per 1 ora / giorno (stessa ora ogni giorno), 5 giorni / settimana. NOTA: Qui, di larghezza di 46 centimetri, lunga 69 centimetri, e 40 cm di profondità vasca di plastica è stato utilizzato. <ol><li> Mantenere novità presentando un diverso insieme di giocattoli ogni sessione. Giocattoli puliti che devono essere ri-presentati a topi con acqua e sapone e l&#39;80% di etanolo per rimuovere i profumi. </li><li> Dopo ogni sessione di SE, restituire i topi alla loro gabbia EE. Maniglia SH e RW topi gli stessi topi SE (ad eccezione di SE stessa) in tutto questo periodo (ad esempio, rimuovere e ritornano ogni SH e RW del mouse da e verso la sua gabbia). </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> Preparazione <ol><li> Utilizzare pompe osmotiche sterili e kit di infusione del cervello, che sono disponibili in commercio. Il giorno prima dell&#39;impianto, utilizzando una tecnica asettica, primi gli impianti di riempimento ogni pompa, tubo di collegamento e la cannula con la soluzione di droga o di un veicolo sterile (come descritto nelle istruzioni fornite con le pompe). Collegarli insieme e incubare in soluzione fisiologica sterile notte a 37 ° C. Incubare impianti alla droga e veicoli pieni separatamente per evitare la contaminazione incrociata. </li></ol></li><li> Chirurgia. NOTA: A seconda del paese dello sperimentatore, particolari autorizzazioni o di quote di sperimentazione animale sono tenuti a perseguire questo tipo di chirurgia e sperimentazioni post-operatorie. <ol><li> Sterilizzare tutti gli apparecchi chirurgici e utilizzare condizioni asettiche. Anestetizzare un mouse (ad esempio utilizzando 1-2% isofluorane in aria) e collocarlo in un sterecastelletto otaxic. Controllare la profondità dell&#39;anestesia durante tutta la procedura e somministrare un&#39;ulteriore anestesia, se necessario (ad esempio, l&#39;assenza di recesso arto per nociva zampa pizzico è indicativo di anestesia adeguata). Assicurarsi che gli occhi sono protetti da disseccamento da pomata lubrificante occhio, e che la temperatura corporea del mouse rimane normale per tutta la procedura. </li><li> Effettuare una incisione mediana attraverso la pelle partendo da tra gli occhi e Finitura 2 cm posteriormente al bordo posteriore del cranio. Blunt sezionare la pelle dalla fascia sottostante lungo la schiena del mouse per creare una sottocutanea &#39;tasca&#39; grande abbastanza per adattarsi comodamente la pompa e il tubo di collegamento volta la cannula viene impiantato (il tubo di collegamento non deve essere piegato al termine). Raschiare cancellare la fascia da oltre all&#39;aspetto dorsale del cranio. </li><li> L&#39;utilizzo di un diametro di bava dentale approssimativamente di 1,5 mm, drill-down nel cranio al stereotassico appropriata coordinate uino un sottile strato flessibile di resti ossei. Peel questo strato di distanza utilizzando una pinza sottile (questo evita di danneggiare la sottostante dura madre e il cervello con la bava dentale). Assicurarsi che il cranio è pulito di eventuali frammenti di sangue e ossa, e che non c&#39;è più il sanguinamento. </li><li> Con la cannula tenuto da un supporto cannule, posizionare la pompa e tubo di collegamento in &#39;tasca&#39; sottocutanea sovrastante schiena del mouse. Successivamente, posizionare la punta della cannula in opportuni coordinate stereotassica e sulla superficie del cervello. Abbassare con cautela la cannula nel cervello, ma smettere di circa 1 millimetro brevi della profondità richiesta. NOTA: La profondità residua sarà negoziato dopo l&#39;applicazione del primo strato di acrilico dentale. </li><li> Verificare nuovamente la superficie del cranio è pulito ed asciutto, quindi preparare un piccolo volume di acrilico dentale e utilizzare uno stuzzicadenti per lisciare sull&#39;intera area esposta del cranio, compreso nel bava foro attraverso il cranio intorno the cannula. Prima l&#39;acrilico indurisce, abbassare la cannula punta la profondità residua nel bersaglio. </li><li> Preparare un&#39;altra piccolo volume di acrilico dentale e questo strato sul primo, così come il supporto plastico bianco per la cannula, per fissare la cannula in posizione. Ripetere con ulteriori strati di acrilico, se necessario. </li><li> Una volta che l&#39;acrilico è indurito, rimuovere con attenzione il supporto cannule e tagliare la plastica scheda cannula rimovibile bianco con una lama di bisturi riscaldata con una fiamma butano. Infine, suturare la pelle chiusa sull&#39;intero impianto. </li></ol></li><li> Il trattamento post-chirurgico di animali <ol><li> Applicare pomata antisettica ai margini della pelle, e somministrare un antinfiammatorio al mouse (es meloxicam, 3 mg / kg sc). Rimuovere il mouse dal telaio, posizionarlo sotto una lampada di calore, e osservare fino a che non riprende conoscenza. Non restituire un topo che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. NOTA: Expmanipolazioni erimental quali l&#39;associazione di genere e ambiente di arricchimento possono essere avviate o ripresi il giorno dopo l&#39;intervento chirurgico al più presto. </li><li> Monitorare loro peso corporeo, comportamento generale e l&#39;aspetto quotidiana. Trattare segni di infezione (ad esempio gonfiore, arrossamento, pus) intorno incisioni chirurgiche con attualità pomata antisettica. Trattare tutti i segni di malattia, il dolore, lo stress o disagio (ad esempio la perdita di&gt; 10% del peso corporeo, ritiro sociale, la mancanza di governare, &quot;smerigliatura&quot;, movimento disfunzioni, convulsioni) con analgesici e / o antibiotici sistemici necessari. </li><li> Euthanize topi se&gt; 15% di perdita di peso o sintomi di malattia, il dolore, lo stress o disagio non sono recuperabili entro 1 settimana di trattamento curativo. </li></ol></li></ol> 3. tessuto cerebrale Preparazione, immunoistochimica Processing, e Stereology <ol><li> Perfusion <ol><li> Subito dopo manipolazioni / droga ambientali, preparare il cervello per lo studio. <br/&gt; NOTA: Negli esperimenti qui riportati sono stati misurati il ​​numero di SNc TH + neuroni e confrontata in ciascuno dei diversi gruppi di trattamento. </li><li> Prima somministrare una overdose di anestetico per uccidere i topi (ad esempio 100 mg / kg ip sodio pentobarbitone). Una volta anestetizzato ma prima che il cuore smette di battere, porre il mouse sulla sua schiena e cravatta o definire con precisione entrambi arti anteriori. </li><li> Usando un bisturi tagliare via la pelle sovrastante torace poi incise attraverso il muscolo appena sotto la gabbia toracica nella cavità addominale. Inserire un morsetto sul processo xifoideo della gabbia toracica e sollevare la gabbia toracica e lontano dal fegato esporre il diaframma. </li><li> Tagliare il diaframma e attraverso le nervature laterali su entrambi i lati con forbici grandi fino alla cassa toracica può essere ripiegato sopra la testa per esporre i polmoni e il cuore. Usando forbici sottili fanno una piccola incisione nell&#39;atrio destro come un punto di uscita di sangue e soluzioni perfusi, poi tagliare attraverso la base del ventri sinistraCLE e posizionare una cannula attraverso il ventricolo sinistro, l&#39;atrio sinistro, e nell&#39;aorta. </li><li> Fissare la cannula in posizione poi pompa calda (37 ° C) eparinizzate e 0,1 M tampone fosfato fisiologica (PBS) attraverso il sistema vascolare fino soluzione uscendo nell&#39;atrio destro è completamente priva di sangue. Successivamente, la pompa fredda (4 ° C) soluzione fissativa (ad esempio 4% paraformaldeide in PBS) attraverso il sistema vascolare finché l&#39;intero mouse è ben fissato. Rimuovere il cervello e il luogo in PBS con il 30% di saccarosio per 2-3 giorni fino a quando i lavandini del cervello. NOTA: Altri tipi di preparazione del tessuto possono essere applicati a seconda della perizia in laboratorio corrispondente. </li></ol></li><li> Preparazione di criosezioni gratuita flottante <ol><li> Tagliare sezioni seriali attraverso le regioni cerebrali di interesse e raccogliere questi in PBS. NOTA: Abbiamo tagliato 40 sezioni micron di spessore con un criostato. Altri tipi di sezionamento del tessuto possono essere applicati a seconda della competenza nel corriLaboratorio ng. </li></ol></li><li> Immunoistochimica <ol><li> Eseguire immunoistochimica standard per le proteine ​​di interesse. Incubare sezioni 5% siero di capra normale e 0,3% triton X-100 in PBS a temperatura ambiente per 30 min, poi immunoreact con coniglio policlonale anti-TH (1: 400) a 4 ° C per 48 ore, poi policlonale di capra anti biotinilato -rabbit (1: 1.000) a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Successivamente, incubare in avidina-perossidasi (1: 500) a temperatura ambiente per 1 ora, poi in cobalto e nichel-intensificato diammino-benzidina (0,5 mg / ml) a temperatura ambiente per 18-20 min; per l&#39;ultimo 3-5 min di incubazione diamino-benzidina aggiungere perossido di idrogeno (0,01%) per catalizzare precipitazione cromogeno. Lavare sezioni tre volte per 10 minuti ciascuno in PBS prima, dopo, e tra ciascuno dei passaggi precedenti. </li><li> Montare le sezioni su vetrini da microscopio gelatinizzati, aria asciugarle, poi macchia Nissl (rosso neutro), disidratano in alcool, chiaro (X-3B), e coprioggetto. </li></ol></li><li&gt; Stereology <ol><li> Stimare il numero totale di neuroni TH + e TH SNc (LC e VTA e) con metodi stereologici imparziali. Assicurarsi che il stereologist è cieco per il trattamento ricevuto. Escludi glia sulla base del diametro di soma &lt;5 micron e contare solo le cellule con un nucleo visibile. </li><li> Identificare il SNc (e VTA e LC) per le posizioni spaziali di cellule TH + e anatomici famosi / confini secondo l&#39;atlante del cervello di Paxinos e Watson 7. Contare TH + cellule entro un conteggio telaio (55 x 55 um = 3025 micron 2) ad intervalli predeterminati regolari (x = 140 micron, y = 140 micron per SNc; x = 100 micron, y = 100 micron per VTA e LC) nel corso di ogni nucleo in ogni quarta sezione. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Manipolazioni ambientali La motivazione alla base della progettazione di queste manipolazioni ambientali (abbinamento di genere e di arricchimento ambientale) è stato quello di determinare se l&#39;ambiente, e / o il comportamento richiesto dall&#39;ambiente, è associata a cambiamenti nel numero di mesencefalo neuroni DA. L&#39;attenzione è quindi di fornire ambienti e stimolando comportamenti che potrebbero coinvolgere la segnalazione DA mesencefalo. Questi abbinamento incluso con ...

DArgic segnalazione dai neuroni nell&#39;area ventrale tegmentale (VTA) e la substantia nigra pars compacta (SNC) del mesencefalo è pensato per essere importante per i comportamenti cognitivi, emotivi e motori ricompensa motivati. Tuttavia, troppo o troppo poco di segnalazione DA mesencefalo provoca molti sintomi invalidanti in una serie di disturbi neurologici (ad esempio il morbo di Parkinson, deficit di attenzione e iperattività, schizofrenia, e tossicodipendenza). I farmaci che aumentano o diminuiscono DA segnalazione alleviare questi sintomi, ma producono anche effetti collaterali riconducibili alla segnalazione disregolato ed effetti off-target. Efficacia Drug declina anche nel tempo a causa di reazioni compensatorie del cervello. La sfida è quindi di ripristinare la normale segnalazione DA mesencefalo in modo più mirato e fisiologico, e un approccio preferito è aumentando o diminuendo il numero di mesencefalo neuroni DA. La prova si è accumulato per SEVdecenni rale che l&#39;espressione di geni e proteine ​​coinvolte nel metabolismo e il traffico DA e altre catecolamine in cellule adulte mature è modificabile (recensito in 1). Nel mesencefalo, il numero di tirosina idrossilasi immunopositive (TH +, l&#39;enzima limitante nella sintesi) DA neuroni diminuisce quindi aumenta in seguito alla somministrazione neurotossina 2,3, mentre il numero di TH immunonegative (TH) neuroni mostra l&#39;andamento opposto (vale a dire gli aumenti poi diminuisce 3). Questo è coerente con la perdita poi guadagno del &#39;DA fenotipo&#39; da alcune cellule. Il numero di neuroni TH + e TH SNC è stato anche dimostrato di modificare in direzioni uguali ma opposti seguente vari trattamenti che alterano l&#39;attività elettrica di queste cellule 4,5. Ad esempio, l&#39;infusione della piccola conduttanza, potassio calcio-attivata (SK) canale antagonista Apamina nel mesencefalo per 2 settimane diminuisce il numero di TH + e aumenta (dello stesso importo) il number di TH SNc neuroni 4,5. Al contrario, l&#39;infusione di SK agonisti canale 1-EBIO aumenta il numero di TH + e diminuisce (dello stesso importo) il numero di neuroni TH SnC 4,5. Modifiche simili sono state osservate in seguito a una serie di trattamenti mirati SNc attività neuronale, tra cui alcuni che mira ingressi afferenti 4. Questa apparente regolazione del numero di neuroni SNc DArgic per attività neuronale e input afferenti solleva la possibilità che l&#39;ambiente o il comportamento possono influenzare il numero di neuroni SnC. Infatti topi adulti esposti ad ambienti differenti hanno più o meno mesencefalo (SNC e VTA) TH + neuroni, e almeno alcuni di questi cambiamenti ambientali indotti sono soppressi dal blocco concomitante di ingresso sinaptica nel mesencefalo 6. Gli obiettivi di questa comunicazione sono: (1) fornire ulteriori dettagli su come implementare le nostre manipolazioni ambientali e infusi di droga; e (2) fornire ulteriori dati a sostegno della nostra tesi che la postanvironment regola il numero di mesencefalo neuroni DA, tramite l&#39;ingresso afferente.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia</td><td>AHN3640</td><td></td></tr><tr><td>Pompa osmotica ALZET 1002</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004317</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Kit per infusione cerebrale 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004760</td><td></td></tr><tr><td>Porta cannula ALZET 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0008860</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Monomero Autopolimerizzante (solvente acrilico dentale)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Paesi Bassi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Self Curing (polvere acrilica dentale)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Paesi Bassi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>METACAM (Meloxicam)</td><td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia</td><td>L10100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone di sodio</td><td>Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia</td><td>571177</td><td></td></tr><tr><td>Normale siero di capra</td><td>chemicon-temecula, CA</td><td>S26-Litre</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Millipore Headquarters&nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio policlonale anti-tirosina idrossilasi</td><td>Merck Millipore Headquarters&nbsp;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Capra biotinilata policlonale anti-coniglio</td><td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060</td><td>EO432</td><td></td></tr><tr><td>Avidin perossidasi</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>A3151-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Diamino-benzidina</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

modulazioni ambientali del numero di mesencefalo dopamina neuroni in topi adulti

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Cambiamenti di lunga durata nel cervello o &#39;plasticità cerebrale&#39; alla base di un comportamento adattivo e riparazione del cervello a seguito di malattia o infortunio. Inoltre, le interazioni con l&#39;ambiente possono indurre la plasticità cerebrale. Sempre più spesso, la ricerca sta cercando di identificare quali ambienti stimolare la plasticità del cervello favorevole per il trattamento del cervello e disturbi comportamentali. Due manipolazioni ambientali vengono descritti che aumentare o diminuire il numero di tirosina idrossilasi immunopositive (TH +, l&#39;enzima limitante della dopamina (DA) sintesi), i neuroni del mesencefalo topo adulto. Il primo comprende accoppiamento topi maschi e femmine insieme ininterrottamente per 1 settimana, che aumenta TH + mesencefalo neuroni di circa il 12% nei maschi, ma diminuisce TH + mesencefalo neuroni di circa il 12% nelle femmine. Il secondo comprende topi abitative ininterrottamente per 2 settimane in &quot;ambienti arricchiti» (EE) contenenti ruote corsa, giocattoli, corde, materiale di nidificazione, ecc, che increases TH + mesencefalo neuroni di circa il 14% nei maschi. Inoltre, un protocollo è descritto per infusione contemporaneamente farmaci direttamente nel mesencefalo durante queste manipolazioni ambientali per identificare i meccanismi alla base della plasticità cerebrale ambientale indotta. Ad esempio, EE-induzione di più TH + mesencefalo neuroni è abolito dal blocco concomitante di ingresso sinaptica sui neuroni del mesencefalo. Insieme, questi dati indicano che le informazioni circa l&#39;ambiente viene trasmessa tramite l&#39;ingresso sinaptica di neuroni mesencefalo per attivare o disattivare l&#39;espressione di geni &#39;DA&#39;. Così, la stimolazione ambientale adeguata, o drug targeting dei meccanismi alla base, potrebbe essere utile per il trattamento di disturbi cerebrali e comportamentali connessi con gli squilibri in mesencefalo DA (ad esempio il morbo di Parkinson, deficit di attenzione e iperattività, schizofrenia, e la tossicodipendenza).

Topi adulti sottoposti a queste manipolazioni ambientali hanno alterato il numero di mesencefalo (snc e VTA), ma non LC, TH + neuroni, e EE più concomitante infusione mesencefalo di una picrotossina o bicucullina (GABA A antagonisti dei recettori) abolisce EE-induzione di più SNc TH + neuroni. Questi dati sono stati precedentemente pubblicati in 6. I dati presenti sono stati raccolti in esperimenti replicati eseguiti come parte di tale studio precedente, ma non sono stati pubblicati altrove. <p...

Questo protocollo descrive due diverse manipolazioni ambientali e un protocollo di infusione cerebrale concomitante per studiare i cambiamenti cerebrali indotti dall'ambiente alla base del comportamento adattivo e della riparazione cerebrale nei topi adulti.

Modulazioni ambientali del numero di Mesencefalo dopamina neuroni in topi adulti

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è creare condizioni ambientali controllate in grado di stimolare la plasticità cerebrale e modifiche comportamentali nei topi. Questo risultato si ottiene alloggiando i topi in coppie maschio-femmina rispetto a coppie di controllo maschio-maschio e femmina-femmina, per studiare gli effetti dell'accoppiamento prolungato per genere sul cervello; in alternativa, i topi possono essere alloggiati insieme in gabbie contenenti diversi oggetti per l'esplorazione e il gioco, rispetto a gabbie standard, per studiare gli effetti dell'arricchimento ambientale sul cervello. Altre trattamenti, come la somministrazione di farmaci, possono essere aggiunti a queste stimolazioni ambientali per aiutare a identificare i meccanismi alla base delle modifiche cerebrali e comportamentali osservate.I risultati mostrano che questi arricchimenti ambientali e trattamenti inducono cambiamenti nel numero di neuroni dopaminergici del mesencefalo, dipendenti dalla trasmissione sinaptica GABAergica del mesencefalo. L'arricchimento ambientale è un paradigma che aumenta la stimolazione somatosensoriale, motoria e cognitiva nei topi. Utilizzando questo approccio, studi hanno dimostrato un aumento della neuroplasticità e anche miglioramenti nell'apprendimento e nella memoria in molti modelli di malattia.Le implicazioni di questa tecnica riguardano la comprensione dei meccanismi di plasticità del cervello adulto indotti da influenze ambientali. E questo è rilevante per il trattamento di numerose malattie del cervello e della mente. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che il numero di neuroni dopaminergici del mesencefalo varia in risposta a perturbazioni dell'attività neuronale del mesencefalo indotta dagli input sinaptici.La dimostrazione visiva della pompa osmotica e della cannula per infusione cerebrale può risultare fondamentale, poiché queste procedure possono essere molto difficili da apprendere. Descrizioni scritte per l'accoppiamento per sesso. Allevare in gruppo topi maschi e femmine sessualmente maturi, abbinati per età, separati per sesso, evitando l'accoppiamento tra fratelli; posizionare casualmente ciascun topo in coppie di maschio-maschio, femmina-femmina o maschio-femmina, in una gabbia pulita e in isolamento, con libero accesso a cibo e acqua, come indicato anche per tutto il periodo dell'accoppiamento per sesso.Mantenere costanti o ugualmente distribuiti tutti gli stimoli ambientali estranei e alloggiare gli animali in modo continuativo per sette giorni. Per l'arricchimento ambientale, assegnare in modo casuale topi maschi o femmine adulti e di pari età a uno dei tre gruppi: alloggiati in condizioni standard, con ruota per correre o in ambiente arricchito, per almeno tre giorni. Mantenerli in queste condizioni.Con libera accesso a cibo e acqua per 14 giorni. Durante l'arricchimento ambientale, la gabbia standard deve contenere solo lettiera. La gabbia con ruota per correre deve contenere lettiera più due ruote, e quella con arricchimento ambientale deve avere lettiera, due ruote per correre e giocattoli.Sottoporre i topi arricchiti dall'ambiente a un ulteriore arricchimento superiore posizionandoli insieme in una gabbia più grande contenente giocattoli nuovi per un'ora al giorno. Nello stesso momento ogni giorno per cinque giorni alla settimana, riportare i topi nella loro gabbia arricchita dall'ambiente. Dopo ogni sessione, mantenere la novità presentando un diverso insieme di giocattoli per ciascuna sessione.Pulire tutti i giocattoli che verranno presentati ai topi con acqua saponata ed etanolo al 80%. Per rimuovere qualsiasi odore, spostare i gruppi standard di topi ospitati e le ruote per correre nello stesso modo e per un periodo di tempo simile ogni giorno, ma senza aggiungere i materiali di arricchimento superiore il giorno precedente l'implantazione. Utilizzando una tecnica asettica, riempire ogni pompa osmotica sterile, tubo di collegamento e cannula con soluzione sterile del farmaco o del veicolo seguendo le istruzioni del produttore.Quindi collegare insieme i pezzi e incubarli tutta la notte in soluzione salina sterile a 37 gradi Celsius nel giorno dell'intervento chirurgico. Dopo aver confermato la sedazione mediante il test del pizzicotto plantare, applicare un unguento oculare all'animale e posizionarlo in posizione supina su un tappetino riscaldante. Successivamente, utilizzando una tecnica asettica, praticare un'incisione mediana attraverso la cute, partendo da due centimetri posteriori al margine posteriore del cranio e terminando tra gli occhi; quindi, con una dissecazione ottusa, staccare la cute dalla fascia sottostante lungo la schiena del topo, creando una tasca sottocutanea sufficientemente ampia da contenere comodamente la pompa e il tubo di collegamento.Quindi raschiare la fascia per pulirla dalla parte dorsale del cranio e utilizzare una fresa dentale di circa 1,5 millimetri di diametro per trapanare il cranio alle coordinate stereotassiche appropriate, fino a quando rimane uno strato sottile e flessibile di osso; rimuovere quindi questo strato con pinzette fini. Una volta che il cranio è stato ripulito da qualsiasi traccia di sangue e frammenti ossei e non si verifica ulteriore sanguinamento, utilizzare un supporto per cannula per posizionare la pompa e il tubo di collegamento nella tasca appena creata. Posizionare ora la punta della cannula alle coordinate stereotassiche appropriate sulla superficie del cervello, quindi abbassare con attenzione il tubo nel cervello, fermandosi un millimetro al di sopra della profondità richiesta.Assicurarsi che la superficie del cranio sia nuovamente pulita e asciutta, quindi utilizzare uno stuzzicadenti per stendere l'acrilico dentale appena preparato su tutta l'area esposta del cranio, compresa la perforazione attorno alla cannula, prima che l'acrilico si indurisca. Abbassare ulteriormente la punta della cannula fino alla profondità residua del bersaglio. Una volta posizionata la cannula, applicare con attenzione un secondo strato di acrilico dentale appena preparato sul cranio e sulla base in plastica bianca della cannula, fissandola così in posizione.Una volta che l'acrilico si è indurito, rimuovere con attenzione il supporto del cannula e utilizzare una lama di bisturi riscaldata per sciogliere la linguetta di plastica della cannula. Quindi suturare la pelle chiudendo completamente l'impianto. Applicare un unguento antisettico ai margini della pelle e somministrare un antiinfiammatorio all'animale.Infine, rimuovere il topo dal supporto. Posizionarlo sotto una lampada a infrarossi e monitorare l'animale fino al completo recupero. Topi maschi adulti accoppiati con topi femmine adulti per sette giorni presentano circa il 12% in più di neuroni positivi per la tirosina idrossilasi nell'area SNC del mesencefalo rispetto ai maschi accoppiati con altri maschi.Al contrario, le femmine accoppiate con maschi presentano circa il 12% in meno di neuroni positivi per TH nella SNC rispetto alle femmine accoppiate con altre femmine. Il numero di neuroni positivi per TH nella SNC e nell'area tegmentale ventrale aumenta anche nei topi maschi adulti sottoposti a un accoppiamento in ambiente arricchito più un super arricchimento per 14 giorni. Con l'arricchimento ambientale più il super arricchimento, gli animali trattati con veicolo mostrano circa il 14% in più di neuroni positivi per TH nella SNC.Successivamente, gli animali allevati in condizioni standard e infusi con il veicolo, nonché gli animali sottoposti a un ambiente arricchito più un'alloggiamento di super arricchimento con infusione di antagonista del recettore GABAA, tuttavia, non mostrano questo aumento. Nel tentativo di manipolazioni ambientali, è importante ricordare di ridurre al minimo qualsiasi disturbo agli animali, ad esempio mantenendo il rumore al minimo ed evitando cambiamenti di contenitore. Troppo spesso, quando si allestisce un ambiente arricchito, è fondamentale includere materiali diversi per il nido e mantenere costante il sito del nido per ridurre al minimo lo stress per gli animali.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come manipolare l'ambiente di topi adulti al fine di indurre cambiamenti nel cervello e nel comportamento. Ricordarsi che quando si lavora con farmaci, questi possono essere estremamente pericolosi; pertanto indossare sempre indumenti protettivi durante la preparazione delle pompe osmotiche.

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Primaria dissociato mesencefalo colture di cellule della dopamina permettono per lo studio delle caratteristiche presinaptici dei neuroni dopaminergici. Possono essere utilizzati per monitorare in tempo reale la cinetica di rilascio di dopamina e proteine ​​/ mRNA livelli di regolatori di esocitosi dopamina. Qui vi mostriamo come generare queste culture da neonati di roditori.

Primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati

Un protocollo per l'esecuzione unilaterale 6-OHDA lesioni del fascio proencefalo mediale è descritto nei topi. Questo metodo ha un basso tasso di mortalità (13,3%) con l'89% degli animali sopravvissuti mostrano una perdita&gt; 95% della dopamina striatale e di 90,63 ± -4,02% pregiudizi ipsiversive rotazione verso il lato della lesione.

Sviluppo di un unilateralmente lesionata 6-OHDA modello murino della malattia di Parkinson

La dopamina è distintamente regolata nel mesencefalo nuclei, che contengono la cella corpi e dendriti dei neuroni dopaminergici. Qui si descrive un approccio di dissezione e di manipolazione dei campioni per massimizzare i risultati e, quindi, le conclusioni e le intuizioni, sulla regolamentazione dopamina nel mesencefalo nuclei della substantia nigra (SN) e la zona ventrale tegmentale (VTA) in roditori.

Profiling completa del regolamento dopamina nel substantia nigra e ventrale tegmentale Area

Nella malattia e dei disordini del movimento di Parkinson, in generale, le analisi comportamentali sensibili e affidabili sono essenziali per testare nuove potenziali terapie. Qui, descriviamo una batteria gestibile di prove sensomotorie per i topi che sono sensibili a vari gradi di lesioni al sistema nigrostriatal e utile per gli studi preclinici.

Valutazione della Sensorimotor funzione in modelli murini di malattia di Parkinson

Sono descritti metodi per la manipolazione e l'analisi di NF-kB-dipendente ippocampali neurogenesi adulta. Un protocollo dettagliato è presentato per un test comportamentale giro dentato-dipendente (definito il modello di separazione-Barnes labirinto spaziale) per la ricerca di esito cognitivo nei topi. Questa tecnica dovrebbe inoltre contribuire a permettere indagini in altri contesti sperimentali.

Metodi per la modulazione e analisi di NF-kB-dipendente adulti neurogenesi

Gli isozimi lipossigenasi (LOX) possono generare prodotti che possono aumentare o diminuire la neuroinfiamminazione e la neurodegenerazione. Uno studio di interazione gene-ambiente potrebbe identificare effetti specifici dell'isozima LOX. L'uso del modello 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) del danno nigrostriatale in due linee transgeniche carenti di isozima LOX consente il confronto del contributo degli isozimi LOX sull'integrità dopaminergica e sull'infiammazione.

Modelli di interazione gene-ambiente per smascherare i meccanismi di suscettibilità nel morbo di Parkinson

I neuroni dopaminergici svolgono un ruolo regolatore vitale nel cervello. La loro perdita è associata al morbo di Parkinson. In questo video, mostriamo come generare colture primarie di neuroni dopaminergici centrali da mesencefalo embrionale di topo. Tali colture sono utili per studiare l'estrema vulnerabilità di questi neuroni a vari stress.

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Le cause della degenerazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo durante il morbo di Parkinson non sono completamente comprese. I sistemi di coltura cellulare forniscono uno strumento essenziale per lo studio delle proprietà neurofisiologiche di questi neuroni. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato, che può essere utilizzato per la modellazione in vitro della neurodegenerazione.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Assorbimento della dopamina sinaptosomiali e strumenti sperimentali rappresentano di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni per indagare l'omeostasi della dopamina nei topi valutando la funzione del trasportatore della dopamina e livelli della dopamina in tessuto striatal, rispettivamente. Qui presentiamo i protocolli per misurare il contenuto di tessuto di dopamina e di valutare la funzionalità del trasportatore della dopamina.

Valutazione dell'omeostasi dopaminergici in topi tramite l'uso di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni e assorbimento della dopamina sinaptosomiali

Questo lavoro presenta un protocollo passo-passo per la valutazione imparziale stereologiche dei numeri di un neurone delle cellule dopaminergiche nel nigra di substantia del mouse utilizzando attrezzature di microscopia standard (cioè, un microscopio ottico, una tabella di oggetto motorizzato (x, y, z aereo) e software di pubblico dominio per analisi digitale delle immagini.

Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature

Abbiamo sviluppato un modello di stress da sconfitta sociale accelerata per topi adolescenti C57BL/6, che funziona sia nei maschi che nelle femmine e consente l'esposizione durante periodi discreti dell'adolescenza. L'esposizione a questo modello induce l'evitamento sociale, ma solo in un sottogruppo di topi maschi e femmine sconfitti.

Modello di stress di sconfitta sociale per topi maschi e femmine adolescenti C57BL / 6

Scopri come manipolazioni ambientali e arricchimento influenzano la neuroplasticità nel mesencefalo di topi adulti. Questo metodo permette di studiare i neuroni dopaminergici e i meccanismi sinaptici GABAergici.

Modulazioni ambientali del numero di Mesencefalo dopamina neuroni in topi adulti

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