Name: Sfruttando la domanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder cicloaddizione per Pretargeted PET Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Scopri la cicloaddizione bioortogonale Diels-Alder per l'imaging PET pretargeted nel cancro colorettale. Questo metodo utilizza anticorpi TCO e radioligandi tetrazinici per ottenere immagini ad alto contrasto con minore dose di radiazioni.

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Gli autori ringraziano il Prof. Ralph Weissleder, il Dr. Pat Zazzonico e il Dr. NagaVaraKishore Pillarsetty per le utili conversazioni e il NIH per il finanziamento (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

ETICA DICHIARAZIONE: Tutti gli esperimenti sugli animali in vivo descritti sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato e alle linee guida etiche del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Sintesi di Tz-Bn-NOTA <ol><li> In un piccolo recipiente di reazione, sciogliere 7 mg NH 2--BN NOTA (1,25 x 10 -2 mmoli) in 600 microlitri tampone di NaHCO3 (0,1 M, pH 8,1). Controllare il pH della soluzione. Se necessario, regolare il pH della soluzione a 8,1 utilizzando piccole aliquote di 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Aggiungere la soluzione di NH 2 -BN-NOTA a 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) in una provetta 1,7 ml microcentrifuga. NOTA: Il Tz-NHS può essere sia pesato secco o aggiunta di una soluzione madre di DMF secco o DMSO (&lt;50 ml). </li><li> Lasciare la soluzione di reazione risultante a reagire per 30 minuti a RTcon agitazione lieve. </li><li> Dopo 30 minuti, purificare il prodotto con fase inversa C 18 cromatografia HPLC per rimuovere reagito NH 2 -BN-NOTA. L&#39;NH 2 -BN-NOTA può essere monitorato alla lunghezza d&#39;onda di 254 nm, mentre il TZ-NHS e Tz-Bn-NOTA sono meglio controllati alla lunghezza d&#39;onda di 525 nm. NOTA: I tempi di ritenzione sono ovviamente fortemente dipendente dalla configurazione apparecchiature HPLC di ogni laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc). Tuttavia, per presentare un esempio, se un gradiente di 0: / H 2 O (entrambi con 0,1% TFA) a 100 100 MeCN: 0 MeCN / H 2 O oltre 25 min ed una analitica 4,6 x 250 millimetri C 18 colonna viene utilizzata , i tempi di ritenzione di Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, e NH 2 -BN-NOTA si aggirano intorno a 15 min, 16.5 min, e 10 minuti rispettivamente. Il prodotto può essere purificato dagli altri componenti della reazione in un singolo run o più corse con un C 18 colonna HPLC semi-preparativa o preparativo. 1 H-NMR, analeytical HPLC, e ESI-MS sono tutti i metodi che possono essere utilizzati per verificare la purezza del completamento precursore Tz-Bn-NOTA. 11 </li><li> Congelare l&#39;eluente HPLC raccolti con azoto liquido. </li><li> Avvolgere il tubo di raccolta congelato in un foglio di alluminio opaco. </li><li> Posizionare il tubo di raccolta congelati in un recipiente liofilizzazione O / N per rimuovere la fase mobile HPLC. </li><li> Conservare il prodotto purificato (un rosa brillante solido) al buio a -80 ° C. NOTA: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Il precursore Tz-Bn-NOTA completato è stabile per almeno 1 anno in queste condizioni. </li></ol> 2. Preparazione di huA33-TCO immunoconiugato <ol><li> In una provetta 1,7 ml, preparare un 1 mg / ml (2,7 mM) soluzione TCO-NHS in secca DMF. </li><li> In una provetta 1,7 ml microcentrifuga, preparare un 2 mg / ml (13,3 micron) di huA33 in 1 ml di tampone fosfato, pH 7.4 (0,01 M PO 4 3-, </sub&gt; 0,154 M NaCl). </li><li> Utilizzando piccole aliquote (&lt;5 microlitri) di 0,1 M Na 2 CO 3, regolare il pH della soluzione a 8,8-9,0 anticorpi. Utilizzare la carta pH o pH-metro con un microelettrodo per monitorare il pH, e fare attenzione a non permettere il pH di elevarsi al di sopra di pH 9,0. </li><li> Una volta che la soluzione di anticorpo è alla giusta pH, aggiungere un volume della soluzione TCO-NHS corrispondenti a 8 equivalenti molari di dell&#39;estere attivato. Ad esempio, aggiungere 7,9 ml di 1 mg / ml soluzione TCO-NHS (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) per il 1 ml di soluzione di 2 mg / ml di anticorpi huA33 (1.33 x 10 -8 mol huA33). Non superare il 5% in volume DMF nella soluzione. </li><li> Mescolare delicatamente la soluzione invertendo la provetta diverse volte. </li><li> Avvolgere la provetta in un foglio di alluminio opaco. </li><li> Lasciare che la soluzione per incubare per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione lieve. </li><li> Dopo 1 ora a RT, purificare l&#39;immunoconiugato risultante con un siz getta preconfezionatoe l&#39;esclusione colonna dissalazione. Innanzitutto, lavare la colonna esclusione dimensionale come descritto dal fornitore per rimuovere eventuali conservanti presenti nella colonna durante la conservazione. Quindi, aggiungere la miscela di reazione alla colonna esclusione dimensionale, lavare la colonna con 1,5 ml 0,9% soluzione salina sterile, e successivamente raccogliere il prodotto con 2 ml di 0,9% soluzione salina sterile come eluente. NOTA: Questo passaggio produrrà il completamento huA33-TCO come soluzione 2 ml. </li><li> Misurare la concentrazione della risultante huA33-TCO su un UV-Vis spettrofotometro. </li><li> Se una concentrazione maggiore è desiderato, concentrare la soluzione huA33-TCO utilizzando un&#39;unità filtro centrifugo con un peso molecolare di 50.000 cut-off. NOTA: E &#39;importante notare che, mentre huA33 e una varietà di altri anticorpi noti (ad esempio, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, e J591) sono molto tolleranti di essere concentrato, l&#39;aggregazione e la precipitazione può verificarsi dalla concentrazione in altri casi. I ricercatori di tentare questo procedUre con un nuovo anticorpo dovrebbe fidarsi letteratura o la propria conoscenza di anticorpo in questione per quanto riguarda se non concentrare l&#39;anticorpo. </li><li> Conservare il completamento immunoconiugato huA33-TCO a 4 ° C al buio. NOTA: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Il completamento coniugato mAb-TCO deve essere stabile per almeno 3 mesi in queste condizioni di conservazione. </li></ol> 3. 64 Cu radiomarcatura di Tz-Bn-NOTA NOTA: Questo passaggio del protocollo comporta il trattamento e la manipolazione di radioattività. Prima di eseguire questi passi - o l&#39;esecuzione di qualsiasi altro lavoro con radioattività - i ricercatori dovrebbero consultarsi con il Dipartimento di sicurezza di radiazione del proprio istituto. Adottare tutte le misure possibili per ridurre al minimo l&#39;esposizione alle radiazioni ionizzanti. <ol><li> In una provetta 1,7 ml, preparare un 0,5 mg / ml (723 um) soluzione di Tz-Bn-NOTA. </li><li> In un MicroC 1,7 mltubo entrifuge, aggiungere 10 ml di soluzione di Tz-Bn-NOTA (5 mg) per 400 ml di 0,2 M NH 4 OAc pH 5,5 tampone. </li><li> Nell&#39;interesse di una corretta radiochimica nota-keeping, misurare e registrare la quantità di radioattività nel campione con un calibratore di dosi prima e dopo i passi successivi nel protocollo di seguito (3,4-3,8). Ciò contribuirà con la determinazione precisa dei rendimenti radiochimica. </li><li> Aggiungi 2.000 uCi (74 MBq) di 64 Cu alla soluzione Tz-Bn-NOTA. NOTA: in genere, [64 Cu] CuCl 2 viene fornito in un piccolo volume (&lt;30 ml) di 0,1 N HCl, e quindi solo piccoli volumi (&lt;10 ml) di questa soluzione madre sono necessarie per la reazione radiomarcatura. Se sono necessari grandi volumi della [64 Cu] CuCl 2 stock, la reazione radiomarcatura è tollerante di aumentare il volume di reazione complessiva. Tuttavia, il pH della soluzione di reazione radiomarcatura devono essere monitorati attentamente per garantireche non scenda al di sotto di pH 4,0. </li><li> Lasciare che la soluzione per incubare per 10 min a RT con agitazione lieve. </li><li> Dopo 10 min di incubazione, purificare il prodotto con fase inversa C 18 cromatografia HPLC. I tempi di ritenzione sono ovviamente altamente dipendenti dalla configurazione apparecchiature HPLC di ogni laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc). Tuttavia, per presentare un esempio, se un gradiente di 5:95 MeCN / H 2 O (entrambi con 0,1% TFA) a 95: 5 MeCN / H 2 O oltre 15 min viene utilizzato, il tempo di ritenzione di 64 Cu-Tz- Bn-NOTA dovrebbe essere di circa 9,8 minuti, mentre la connessione, non complessato 64 Cu si eluire con il fronte del solvente a circa 2-4 min. </li><li> Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere l&#39;eluente HPLC. </li><li> Riprendere il prodotto 64 Cu-Tz-Bn-NOTA nello 0,9% soluzione salina sterile. NOTA: Dato il 12,7 hr fisica emivita di 64 Cu, questo non è un punto di arresto accettabile nel procedimento. Eseguire la sintesi di 64 Cu-Tz-Bn-NOTA immediatamente prima dell&#39;iniezione del radiolegante, e seguire passo 3.7 immediatamente by Step 4.5. </li></ol> 4. In Vivo Pretargeted PET Imaging NOTA: Come nella sezione protocollo 3, questa fase del protocollo comporta la gestione e la manipolazione della radioattività. Prima di effettuare questa procedura i ricercatori dovrebbero consultarsi con il Dipartimento di sicurezza di radiazione del proprio istituto. Adottare tutte le misure possibili per ridurre al minimo l&#39;esposizione alle radiazioni ionizzanti. <ol><li> In una femmina atimici topo nudo, impianto sottocute 1 x 10 6 SW1222 cellule tumorali del colon-retto e permettere a questi di crescere in un xenotrapianto 100-150 mm 3 (9-12 giorni dopo l&#39;inoculazione). 11 </li><li> Diluire un&#39;aliquota della soluzione huA33-TCO dalla sezione protocollo 2 ad una concentrazione di 0,5 mg / ml in 0,9% soluzione salina sterile. </li><li> Iniettare 200 microlitri della soluzione di huA33-TCO (100 ug) nella vena della coda del topo xenotrapianto-cuscinetto. </li><li> Consentire 24 ore per l&#39;accumulo del huA33-TCO nel tumore del mouse. </li><li> Diluire il 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligando ad una concentrazione di 1,5 mCi / ml in 0,9% soluzione salina sterile. </li><li> Iniettare 200 ml di soluzione di radiolegante 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (300 uCi; 11,1 MBq; 1.6 nmol di 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, assumendo una specifica attività di 6,7 MBq / nmol) nella vena della coda del xenotrapianto-cuscinetto topi. </li><li> Al punto di tempo di imaging desiderato (ad esempio, 2, 6, 12 o 24 ore post-iniezione), anestetizzare il mouse con isoflurano 2%: miscela di gas ossigeno. </li><li> Posizionare il mouse sul letto del piccolo scanner PET animali. Mantenere l&#39;anestesia durante la scansione utilizzando una isoflurane 1%: miscela di ossigeno. Prima di mettere l&#39;animale sul piatto dello scanner, verificare l&#39;anestesia con il metodo punta pinch e applicare pomata veterinaria agli occhi del mouse per evitare l&#39;essiccazione durante l&#39;anestesia. </li><li> Acquisire i dati di PET per il mouse con una staticascansione con un minimo di 20 milioni di eventi coincidenti utilizzando una finestra di energia di 350-700 keV ed una finestra di temporizzazione coincidenza di 6 nsec. Dopo aver completato l&#39;acquisizione delle immagini, non lasciare incustodito il mouse e non metterlo in una gabbia con altri topi fino a quando non ha ripreso conoscenza. </li></ol>

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<li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li>
<li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li>
<li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting%3A+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li>
<li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il principale vantaggio di questa strategia PET pretargeted è che è in grado di delineare tumori con contrasto immagine target-to-background soltanto ad una frazione della dose di radiazione di fondo prodotto da anticorpi marcati direttamente. Ad esempio, nel sistema di imaging del cancro del colon-retto qui descritto, i dati provenienti da esperimenti biodistribuzione acuti sono stati impiegati per eseguire i calcoli di dosimetria per la strategia basata pretargeting-Cu 64 con direttamente marcato 64</s...

Negli ultimi trent&#39;anni, tomografia ad emissione di positroni (PET) è diventato uno strumento indispensabile clinica nella diagnosi e gestione del cancro. Anticorpi sono stati a lungo considerati vettori promettenti per la fornitura di radioisotopi ad emissione di positroni per tumori a causa della loro affinità squisita e specificità per biomarcatori tumorali. 1,2, tuttavia, relativamente lenti farmacocinetica in vivo di anticorpi mandati l&#39;uso di radioisotopi con più giorni emivita fisica. Questa combinazione può produrre alte dosi di radiazioni agli organi non bersaglio di pazienti, una complicazione importante che è di particolare rilevanza clinica poiché radioimmunoconjugates vengono iniettati per via endovenosa e quindi - a differenza parziali scansioni corpo CT - risultato in dosi assorbite in ogni parte del corpo, indipendentemente tessuti interrogati. Per evitare questo problema, notevole sforzo è stato dedicato alla svipment di strategie di imaging PET che disaccoppiare radioisotopo e la frazione di targeting, sfruttando in tal modo le proprietà vantaggiose di anticorpi e contemporaneamente costeggiando i loro limiti farmacocinetiche intrinseche. Queste strategie - spesso definito pretargeting o il targeting più fasi - tipicamente impiegano quattro fasi: (1) la somministrazione di un anticorpo in grado di legare sia un antigene ed un radioligando; (2) l&#39;accumulo dell&#39;anticorpo nel tessuto bersaglio e la sua clearance dal sangue; (3) la somministrazione di una piccola molecola radioligando; e (4) la legatura in vivo del radioligando all&#39;anticorpo seguita dalla rapida clearance dell&#39;eccesso radioligando. 3-8 In alcuni casi, un agente di compensazione addizionale viene iniettato tra i passaggi 2 e 3, al fine di accelerare l&#39;escrezione di qualsiasi anticorpo che deve ancora impegnare il tumore e rimane nel sangue. 5 In generale, two tipi di strategie pretargeting sono più diffusi in letteratura. Mentre entrambi hanno dimostrato con successo in modelli preclinici, possiedono anche limitazioni chiave che hanno impedito la loro applicabilità clinica. La prima strategia si basa sul alta affinità tra streptavidina anticorpi coniugati e radiolabels biotina-modificato; Tuttavia, l&#39;immunogenicità degli anticorpi streptavidina-modificato ha dimostrato di essere un problema preoccupante per quanto riguarda la traduzione. 5,6,9,10 La seconda strategia, al contrario, impiega anticorpi bispecifici geneticamente ingegnerizzati per legare sia un cancro biomarker antigene e una piccola aptene radiomarcato molecola. 3,11-14 Mentre quest&#39;ultimo rotta è certamente creativo, la sua ampia applicabilità è limitata dalla complessità, spesa, e la mancanza di modularità del sistema. Recentemente, abbiamo sviluppato e pubblicato una metodologia di imaging PET pretargeted basato sulla domanda inversa elettrone Diels-Alder (IEDDA) reazione di cicloaddizione tra -cyclooctene trans (TCO) e tetrazina (Tz;. Figura 1) 11 Mentre la reazione si è stato conosciuto per decenni, IEDDA chimica ha conosciuto una rinascita negli ultimi anni come una tecnica bioconjugation click chemistry, come illustrato da l&#39;affascinante lavoro dei gruppi di Ralph Weissleder, Giuseppe Volpe, e Peter Conti, tra gli altri. 12-15 L&#39;IEDDA cicloaddizione è stato applicato in una vasta gamma di impostazioni, tra cui imaging di fluorescenza con peptidi, anticorpi, e nanoparticelle e di imaging nucleare . con entrambi radiohalogens e radiometalli 16-26 La legatura è ad alto rendimento, pulito, veloce (k 1&gt; 30.000 M -1 sec -1), selettivo, e - critica -. bioorthogonal 27 E mentre un certo numero di tipi di click chemistry - compresi azide-alkyne cicloaddizioni Cu-catalizzata, cicloaddizioni azide-alkyne ceppo-promossa, e Staudinger ligzioni -. bioorthogonal sono pure, è la combinazione unica di cinetica di reazione veloci e bioorthogonality che rende IEDDA chimica così adatto per applicazioni pretargeting in organismi interi 28,29 Lungo queste linee, è importante notare che la recente relazione nostro laboratori non è stato il primo ad applicare IEDDA chimica per pretargeting: il primo rapporto delle immagini pretargeted con IEDDA sorto dal lavoro di Rossin, et al e caratterizzato da una metodologia SPECT impiegando un 111 In marcato tetrazina 30.. Come abbiamo discusso in precedenza, la metodologia pretargeting ha quattro abbastanza semplici passaggi (Figura 2). Nel protocollo a portata di mano, sarà descritta una strategia pretargeted per imaging PET di tumore del colon-retto, che si avvale di un Cu-NOTA-marcato radiolegante 64 tetrazina e un coniugato TCO modificato dell&#39;anticorpo huA33. Tuttavia, in ultima analisi, la modularità di questa metodologia è uno dei suoi grbeni ne mangerai, come la frazione -cyclooctene trans possono essere aggiunti a qualsiasi anticorpo non interiorizzare, e la tetrazina può essere collegato a una grande varietà di giornalisti radioattive.

<table><tbody><tr><td>Tetrazina NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich 764701</td><td></td><td>Store a -80 gradi C</td></tr><tr><td>Trans-ciclooctene NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich 764523</td><td></td><td>Negozio a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>p-NH2-Bn-NOTA</td><td>Macrociclici</td><td>B-601</td><td>Negozio a -80 &deg; E</td></tr></tbody></table>

sfruttando la domanda bioorthogonal inverse electron diels-alder cicloaddizione per pretargeted pet imaging

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Grazie alla loro squisita affinità e specificità, gli anticorpi sono diventati vettori estremamente promettenti per la somministrazione di radioisotopi alle cellule tumorali per l'imaging PET. Tuttavia, la necessità di marcare anticorpi con radionuclidi con lunghe emivite fisiche spesso si traduce in elevati tassi di dose di radiazioni di fondo ai tessuti non bersaglio. Al fine di aggirare questo problema, abbiamo impiegato una strategia di imaging PET premirata basata sulla reazione di cicloaddizione di Diels-Alder a domanda inversa di elettroni. La metodologia disaccoppia l'anticorpo dalla radioattività e quindi sfrutta le caratteristiche positive degli anticorpi, evitando al contempo i loro svantaggi farmacocinetici. Il sistema è composto da quattro fasi: (1) l'iniezione di un coniugato mAb-trans-ciclooctene (TCO); (2) un periodo di localizzazione durante il quale l'anticorpo si accumula nel tumore e si libera dal sangue; 3) l'iniezione della tetrazina radiomarcata; e (4) la click ligation in vivo dei componenti seguita dalla clearance del radioligando in eccesso. Nell'esempio presentato nel lavoro in esame, un radioligando di tetrazina marcato con 64Cu-NOTA e un anticorpo umanizzato coniugato trans-ciclooctene (huA33) sono stati utilizzati con successo per delineare i tumori del cancro del colon-retto SW1222 con un elevato contrasto tumore-fondo. Inoltre, la metodologia di pretargeting produce immagini di alta qualità a solo una frazione della dose di radiazioni al tessuto non bersaglio creata da radioimmunoconiugati marcati direttamente con 64Cu o 89Zr. In definitiva, la modularità di questo protocollo è uno dei suoi maggiori vantaggi, poiché la porzione trans-ciclooctene può essere aggiunta a qualsiasi anticorpo non internalizzante e la tetrazina può essere attaccata a un'ampia varietà di radioisotopi.

Le prime tre fasi dell&#39;esperimento - la sintesi di Tz-Bn-NOTA, la coniugazione di TCO per huA33, e la radiomarcatura della Tz-Bn-NOTA costruiscono (figure 3 e 4) - sono altamente affidabili. Nel caso della procedura sopra, il costrutto Tz-Bn-NOTA stato sintetizzato con alta resa e purezza. L&#39;anticorpo huA33 stato modificato con 4,2 ± 0,6 TCO / mAb e Tz-Bn-NOTA era radiomarcato con 64 Cu a cedere il radiolegante purificato in&gt; 99% di purezza radiochimica,&gt; 85% di...

La cicloaddizione di Diels-Alder per la domanda di elettroni inversi bioortogonali è stata sfruttata per creare una strategia di imaging PET premirata efficace e modulare per il cancro. In questo protocollo, le fasi di questa metodologia sono descritte nel contesto di un sistema modello che impiega l'anticorpo mirato al cancro del colon-retto huA33 e un radioligando marcato con 64Cu.

Sfruttando la domanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder cicloaddizione per Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è preindirizzare il tessuto canceroso utilizzando una reazione bioortogonale tra tetrazina e trans-cicloottina per l'imaging mediante PET. Questo risultato si ottiene iniettando in un topo portatore di tumore un anticorpo marcato con trans-cicloottina, seguito da un periodo di intervallo durante il quale l'anticorpo si accumula lentamente nel tumore e viene eliminato dal sangue. Viene quindi iniettato nello stesso animale un radiofarmaco a base di tetrazina.Il radio ligando si lega a un anticorpo marcato con TCO a livello del tumore e, essendo una molecola di piccole dimensioni, viene rapidamente eliminato dal sangue. L'immagine PET ottenuta su piccoli animali mostra una chiara delimitazione del tumore con elevato contrasto e alti rapporti di attività tumore/fondo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'imaging PET con anticorpi direttamente marcati, è che fornisce immagini ad alto contrasto con solo una frazione della dose di radiazione al paziente.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia, poiché le tecniche di pre-targeting possono erogare quantità molto elevate di radiazioni ai tumori, mentre allo stesso tempo le dosi somministrate agli organi sani e ai tessuti sani saranno molto basse. Dimostrerò questa tecnica insieme a Catherine Kaza, tecnico del nostro laboratorio. La reazione di sintesi inizia sciogliendo sette milligrammi di NH2-BN-NODA in 600 microlitri di bicarbonato di sodio 0,1 M a pH 8,1.Verificare il pH e, se necessario, utilizzare piccole aliquote di carbonato di sodio 0,1 molare per aggiustare il pH a 8,1. Successivamente, aggiungere questa soluzione a 0,5 milligrammi di TZ NHS in un tubo da microcentrifuga. Lasciare incubare la reazione per mezz'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata.Il stock TZ NHS può essere disciolto in DMF o DMSO dopo mezz'ora. Purificare il prodotto mediante HPLC in fase inversa C 18 per rimuovere l'NH inattivo due BN notta, che verrà rilevato a 254 nanometri. Il monitoraggio di TZ NHS e TZ BN Notta è ottimale a 525 nanometri.Il tempo di ritenzione del campione varierà in base all'apparecchiatura, ma utilizzando un gradiente da zero a 100 a 100 a zero di acetonitrile in acqua nell'arco di 25 minuti e una colonna analitica C18 da 4,6 per 250 millimetri, i tempi di ritenzione saranno rispettivamente di 16,5, 15 e 10 minuti per i tre composti. Congelare l'eluato HPLC raccolto in azoto liquido, quindi avvolgere il tubo in un foglio d'alluminio opaco. A questo punto, posizionare il tubo congelato in un contenitore per liofilizzazione e lasciarlo in un liofilizzatore per tutta la notte.Per rimuovere la fase mobile dell'HPLC e verificare la purezza del precursore finale TZ bn no top, utilizzare la spettroscopia HPLC analitica a risonanza magnetica protonica e/o la spettrometria di massa con ionizzazione a spruzzo elettrospray (ESI). Iniziare questa reazione preparando una soluzione 2,7 millimolare di T-C-O-N-H-S in DMF in un tubo da microcentrifuga; in un secondo tubo da microcentrifuga, preparare una soluzione di 2 milligrammi per millilitro di HUA 33 in 1 millilitro di PBS a pH 7,4.Quindi, utilizzando piccole aggiunte di carbonato di sodio 0,1 M, regolare il pH della soluzione tra 8,8 e 9,0, senza superare questo intervallo. Successivamente, aggiungere un volume di T-C-O-N-H-S corrispondente a otto equivalenti molari dell'estere attivato. Mescolare delicatamente la soluzione con qualche inversione e avvolgerla nella pellicola d'alluminio.Quindi posizionare il tubo in incubazione a temperatura ambiente per circa un'ora con agitazione delicata. Dopo un'ora, utilizzare una colonna cromatografica monouso preconfezionata a esclusione dimensionale per desalare e purificare l'immunoconiugato dalla reazione. Aggiungere un millilitro di miscela di reazione sulla colonna e successivamente aggiungere 1,5 millilitri di soluzione salina sterile allo 0,9%.Quindi eluire il prodotto umanizzato HUA 33 TCO con due millilitri di soluzione salina allo 0,9%. Misurare la concentrazione del prodotto mediante spettrometro UV-vis. Se la concentrazione è inferiore a quella desiderata, concentrare il prodotto utilizzando un filtro centrifugo con cutoff di peso molecolare di 50.000.Iniziare preparando una soluzione di 0,5 milligrammi per millilitro di TZ BN notta in un tubo da microcentrifuga. In un secondo tubo da microcentrifuga, aggiungere 10 microlitri della soluzione di TZ BN Notta preparata a 400 microlitri di tampone di acetato di ammonio 0,2 molare a pH 5,5. Assicurarsi di misurare e registrare la quantità di radioattività del campione prima e dopo ciascuno dei passaggi successivi.Questo è essenziale per il calcolo accurato delle rese radiochimiche e per la tenuta dei registri. Aggiungere ora 2000 microcurie di rame-64 alla soluzione TZ BN Notta. Incubare questa miscela a temperatura ambiente per 10 minuti con un leggero agitazione.Per purificare il prodotto, utilizzare una cromatografia liquida ad alta prestazione in fase inversa C18: diluire i prodotti impiegando un gradiente da 5 a 95 e da 95 a 5 di acetonitrile in acqua nell'arco di 15 minuti con lo 0,1% di acido trifluoroacetico (TFA). Il composto radio marcato tz, BN nota eluirà a 9,8 minuti, mentre il rame-64 libero eluirà con il fronte del solvente tra i 2 e i 4 minuti. Dopo aver utilizzato un evaporatore rotante per rimuovere l'eluente dell'HPLC, sciogliere il prodotto radio marcato in soluzione salina sterile allo 0,9% e procedere all'utilizzo del prodotto il più rapidamente possibile. Questa procedura inizia diluendo un'equivalenza dell'olio della soluzione HEA 33 TCO preparata a una concentrazione di 0,5 milligrammi per millilitro in soluzione salina sterile allo 0,9%.Quindi iniettare 200 microlitri della soluzione nella vena della coda del topo portatore di xeno innesto. Lasciare che l'anticorpo umanizzato a 33 TCO circoli e si accumuli nel tumore per 24 ore. Dopo 24 ore, preparare il TZ BN Notta marcato con rame 64 a una concentrazione di 1,5 MILLCURIE per millilitro in soluzione salina sterile 0,9%.Quindi utilizzare un'iniezione nella vena della coda per somministrare 200 microlitri della soluzione di radioligando preparata al topo nel momento desiderato. Anestetizzare il topo e posizionarlo sul lettino di uno scanner per piccoli animali. L'anestesia deve essere mantenuta mediante somministrazione attraverso un cono nasale, e lo stato anestetizzato deve essere confermato mediante una pinzatura del dito del piede.Inoltre, per prevenire l'essiccamento, applicare uno strato sottile di unguento oftalmico. Ora acquisire i dati del soggetto con una scansione statica di 60 milioni di eventi coincidenti a 350-700 chilo elettronvolt e con un tempo di coincidenza di sei nanosecondi; dopo l'imaging, attendere che il topo riprenda conoscenza prima di rimetterlo nella gabbia, eventualmente insieme ad altri topi. Topi nudi timectomizzati portatori di un carcinoma colorettale SW 1222 esprimente l'antigene 33.I xenotrapi sono stati esaminati utilizzando il protocollo descritto. Sia gli esperimenti di biodistribuzione acuta che quelli di imaging PET rivelano che la strategia di pre-targeting è in grado di delineare lo xenotrapi di cancro del colon-retto con un eccellente contrasto d'immagine e alti rapporti di attività tumore-sfondo. Nel corso di alcune ore, il ligando radioattivo viene eliminato con le feci e i rapporti di attività tumore-sfondo diventano molto elevati.Alcune variabili in questo approccio di pre-targeting richiedevano un'ottimizzazione, come avverrebbe per qualsiasi strategia di imaging. L'amministrazione di 300 microgrammi di anticorpo coniugato con TCO invece di 100 microgrammi ha determinato un aumento della radioattività visibile nel cuore del topo, così come la riduzione dell'intervallo da 24 a 12 ore. In entrambi i casi, la reazione di click si è comunque verificata a livello del tumore, come illustrato chiaramente dall'assorbimento tumorale nei primi punti temporali.Tuttavia, la reazione di click avviene chiaramente anche nel sangue, il che non è desiderabile. È necessario raggiungere un equilibrio preciso tra tutte le variabili del pre-targeting quando si tenta questa procedura. È molto importante ottimizzare sia la massa dell'immunoconiugato TCO sia l'intervallo di tempo tra le iniezioni.Non dimenticare che lavorare con la radioattività può essere estremamente pericoloso e che durante l'esperimento è necessario adottare precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale adeguati e assicurarsi che la radiazione sia schermata in ogni momento.

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