Surface Enhanced Raman Spectroscopy Rilevamento di Biomolecole Utilizzando EBL manufatti nanostrutturati Substrati

Descriviamo la fabbricazione e la caratterizzazione di sistemi nanobiologici che interfacciano substrati nanostrutturati con proteine immobilizzate e aptameri. Vengono riportate le fasi sperimentali rilevanti che coinvolgono la fabbricazione litografica di substrati nanostrutturati, la biofunzionalizzazione e la caratterizzazione della spettroscopia Raman potenziata dalla superficie (SERS). È stata dimostrata la rilevazione SERS di proteine immobilizzate in superficie e il sondaggio del legame proteina-ligando e aptamero-ligando.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di fabbricare e caratterizzare sistemi nanobiologici coniugati che interfacciano substrati solidi nanostrutturati con biomolecole immobilizzate. Ciò si ottiene utilizzando la litografia a fascio di elettroni ad altissima risoluzione o EBL per ottenere matrici di minuscole nanostrutture metalliche su supporti di silice fusa. In una seconda fase, i substrati vengono posti in soluzione e le biomolecole vengono immobilizzate sulle loro superfici, producendo le interfacce nanobiologiche.

Successivamente, la spettroscopia di ramen potenziata in superficie o SIRS viene impiegata per sondare le molecole biologiche alle interfacce. Gli spettri sir risultanti mostrano le caratteristiche del modo ramen delle particolari molecole con intensità fortemente dipendenti dal design del substrato. Il vantaggio principale del nostro approccio rispetto alle tecniche esistenti come la spettroscopia a infrarossi è che la sensibilità può essere notevolmente migliorata grazie al plasma superficiale e alla risonanza all'interno delle nanostrutture metalliche.

Il nostro approccio crea superfici altamente selettive che possono essere facilmente controllate utilizzando la combinazione di funzionalizzazione molecolare e litografia a fascio di elettroni. Questo metodo può rispondere a domande chiave in diversi campi, dalla ricerca esplorativa in biologia strutturale o servizi mobilitati dai polimeri allo sviluppo di vari dispositivi che coinvolgono interfacce nanobiologiche. Questi metodi possono fornire nella scienza le proprietà strutturali delle biomolecole con implicazioni che si estendono alla diagnosi medica o al rilevamento ambientale.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà in quanto coinvolge aspetti della nano fabbricazione, della funzionalizzazione delle superfici, della biochimica e della spettroscopia, che sono stati tradizionalmente non correlati Per iniziare a rivestire il polimetilmetacrilato o PMMA, resistere e strati conduttivi sui substrati. Per ottenere ciò, utilizzare una centrifuga per wafer con un mandrino a vuoto e posizionare i campioni singolarmente al centro del mandrino. Posizionare una goccia di PMMA resist al centro dei campioni utilizzando una pipetta di vetro.

Quindi girare a 3.500 giri/min per 60 secondi con un tempo di accelerazione di due secondi. Quindi, cuocere i substrati a 180 gradi Celsius per tre-cinque minuti dopo aver cotto i substrati, raffreddare i campioni a temperatura ambiente con i substrati raffreddati e rimetterli nel mandrino rotante. Stendere una goccia di polimero conduttivo sul substrato.

Centrifuga il substrato per 40 secondi a 3000 giri/min con una rampa di due secondi dopo la rotazione. Cuocere i campioni a 80 gradi Celsius per un minuto dopo aver eseguito la litografia a fascio di elettroni o l'esposizione all'EBL come descritto nel protocollo di testo, preparare un becher con l'acqua ionizzata per rimuovere il polimero conduttivo. Quindi preparare un secondo bicchiere con una miscela di sviluppo e mescolare per cinque minuti, impostare la temperatura ambiente.

Infine, preparare l'isopropanolo in un terzo becher come brillantante utilizzando una pinzetta. Immergere i campioni nell'acqua per tre secondi per rimuovere la pellicola polimerica conduttiva. Quindi posizionare il campione nello sviluppatore e muovere lentamente le pinzette su e giù per 20 secondi, trasferire immediatamente i substrati sull'isopropanolo e risciacquare per altri 10 secondi prima di asciugare il campione con azoto, caricare i campioni capovolti nel sistema di evaporazione a fascio di elettroni per consentire il deposito del metallo evaporato sulla faccia anteriore dei campioni.

Deposita uno strato d'oro spesso 10 nanometri sui campioni per i disegni uno e tre e uno strato d'argento spesso 10 nanometri per il disegno. Due a una velocità di circa 0,1 nanometri al secondo. Quindi riempire un sistema di sonicazione all'altezza consigliata con acqua e riempire un becher separato con acetone.

Posizionare un campione a faccia in su nella parte inferiore del becher e lasciare in ammollo il campione per 10 minuti tenendo il becher. Mettilo nel bagnomaria e lascia che l'altezza dell'acetone corrisponda all'altezza dell'acqua. Quindi accendere il sistema di sonicazione.

Consentire la sonicazione per un massimo di 60 secondi. Per preparare prima i campioni di progetto, preparare una soluzione millimolare di MUA ed etanolo a temperatura ambiente e sonicare per 10 minuti. Immergere il substrato nanostrutturato appropriato nella soluzione di MUA per 48 ore.

Quindi sciacquare il campione con etanolo tre volte e asciugarlo per cinque minuti. Impostare la temperatura ambiente. Successivamente, preparare una soluzione da 75 millimolari di EDC e acqua distillata.

Preparare anche una soluzione da 15 millimolari di NHS in acqua distillata utilizzando un deposito di micropipette, 100 microlitri di NHS sull'oro sul substrato e aggiungere immediatamente 100 microlitri di EDC sulla stessa area. Incubare per un minuto per attivare il monostrato autoassemblato di MUA. Quindi posizionare una goccia da 100 microlitri di proteine, una soluzione sulla stessa area del substrato.

Posizionare il campione in uno scomparto di una piastra di Petri con un millilitro di acqua distillata in un altro scompartimento. Sigillare la capsula di Petri con un coperchio e conservare il campione per 24 ore a cinque gradi Celsius. Quindi, sciacquare il campione in acqua distillata tre volte continuando i campioni in becher separati per 20 secondi in ciascun becher, non lasciare asciugare i campioni dopo il risciacquo o durante il risciacquo per i due campioni di design.

Preparare una soluzione 0,9 millimolare di proteina legante il glucosio o GBP in tampone fosfato di potassio. Preparare anche una soluzione 100 millimolare di glucosio DG nel tampone. Successivamente mescolare 30 microlitri della soluzione di glucosio D e 30 microlitri della soluzione GBP.

Utilizzando un contenitore per microprovette di plastica da un millilitro e una micropipetta, incubare per 30 minuti, quindi depositare 20 microlitri della soluzione GBP priva di ligando e 20 microlitri della soluzione GBP legata al ligando sui substrati preparati. Utilizzando una micropipetta, conservare i campioni a cinque gradi Celsius per 24 ore in una capsula di Petri con coperchio sigillato. Sciacquare i campioni tre volte nella soluzione tampone di fosfato di potassio a temperatura ambiente Per preparare.

Progettare tre campioni diluire il legante della dopamina apre o la soluzione DBA a una concentrazione di un micromolare. Utilizzando il tampone tris EDTA con un pH finale di 7,4, preparare una soluzione di dopamina a una concentrazione di cinque micromolari misurando la polvere di dopamina su una bilancia analitica e mescolandola nella soluzione salina tamponata con fosfato o PBS con una perlina di agitazione per cinque minuti. Quindi depositare una goccia da 20 microlitri della soluzione DBA sulla superficie di ciascun substrato e lasciare riposare il campione per un'ora a temperatura ambiente con un coperchio sopra la capsula di Petri.

Dopo aver risciacquato i campioni tre volte in un tampone di fosfato di potassio, posizionare i campioni in posizione verticale sopra una salvietta per camera bianca per asciugare la parte posteriore mantenendo una pellicola sul lato anteriore del substrato. Metti da parte un campione come controllo. Successivamente, posizionare una goccia di cinque microlitri della soluzione di dopamina sulla superficie del PBS esistente.

Versare sui campioni rimanenti. Incubare i campioni per 10 minuti prima di sciacquarli tre volte nella soluzione tampone di fosfato di potassio. Per eseguire la spettroscopia del ramen.

Posizionare ogni campione in una camera impermeabile per evitare l'evaporazione dovuta all'esposizione laser. Riempire una siringa di plastica con grasso per alto vuoto chimicamente inerte. Quindi posizionare i campioni su vetrini ed erogare alcuni millimetri di grasso che circondano i campioni senza toccare i campioni.

Posizionare un vetrino copritore per microscopio sopra i substrati. Premere delicatamente verso il basso per formare una guarnizione, creando una sottile interfaccia liquida tra i substrati e i vetrini coprioggetti senza permettere al tampone di entrare in contatto con il grasso per vuoto. Utilizzando un sistema di microscopio ottico Raman, ottenere una messa a fuoco sulla superficie della regione del nano pattern metallico da campionare senza accendere il laser.

Eseguire il campionamento Raman come descritto nel protocollo di testo mostrato. Ecco le matrici di punti nano pattern di oro e nichel d'argento su silice fusa. L'uso della litografia a fascio di elettroni o EBL consente una posizione e una dimensione eccellenti.

La dimensione del punto di controllo e la larghezza dello spazio sono controllate dall'esposizione EBL. Qui sono mostrate le matrici esagonali di oro e nichel d'argento. Il comportamento di nucleazione di tali strati metallici molto sottili si traduce in strutture discontinue.

Ecco lo spettro in serie della proteina A immobilizzata del substrato nella progettazione: un'intensità del segnale dall'array uno è molto più forte di quella dell'array due. Il segnale proveniente dall'array tre era molto debole. La spaziatura degli spazi è chiaramente un parametro critico per il disaccoppiamento del plasma e il miglioramento della superficie dello scattering del ramen visualizzato.

Ecco gli spettri della proteina legante il glucosio che mostrano gli effetti di diversi disegni di substrato nello stato libero da ligando e legato al ligando. Infine, gli spettri s dell'aptamero legante la dopamina sono mostrati per molecole libere da ligando e legate al ligando. Uno spettro di polvere di dopamina è mostrato come riferimento.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante evitare la contaminazione dei substrati. Poiché la tecnica di spettroscopia è altamente sensibile e si possono avere false letture utilizzando questa procedura. I modelli ottimali del substrato sorgente possono essere identificati per analiti specifici.

Quindi altri metodi nphy come il phy non di stampa possono essere eseguiti per migliorare la scalabilità della fabbricazione del substrato dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aiutato i ricercatori nel campo della biochimica e del biorilevamento a rilevare molecole biologiche prive di determinate superfici in quantità molto piccole, pur rimanendo in soluzione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come controllare le dimensioni della nanostruttura metallica e le proprietà del film utilizzando tecniche di fabbricazione e come sfruttare diverse strategie di riconoscimento biomolecolare per indirizzare diversi analiti.