Esplorazione dell'applicazione del biosensing basato su scattering Raman potenziato su superficie di singoli sEVs nella diagnosi e nelle terapie delle malattie

Utilizziamo la diffusione Raman potenziata con la superficie combinata con il machine learning per affrontare la diagnostica precoce del cancro e offrire anche applicazioni biomediche. Una sfida sperimentale chiave è l'eterogeneità intrinseca nei campioni esosomi, i dati spettroscopici altamente complessi e ad alta dimensione, ulteriormente aggravati dal basso rapporto segnale-rumore. Per cominciare, pipettare circa cinque microlitri del piccolo campione di vescicola extracellulare sul substrato plasmonico designato.

Mettere il substrato in un essiccatore per lasciare asciugare completamente la goccia per circa 15 minuti. Poi trasferisci il substrato essiccato su un microscopio Raman confocale. Utilizzando il software dello strumento WiRE versione 4.4, avviare la raccolta dati.

Imposta il laser di eccitazione a 785 nanometri a cinque milliwatt e calibra il sistema. Per acquisire spettri dal substrato d'oro, eseguire una scansione di ricognizione su un'area di 300 per 300 micrometri per localizzare singole vescicole usando la modalità statica con una dimensione di passo di 10 micrometri, esposizione di 0,1 secondi e potenza laser del 50%. Una volta localizzate le vescicole, esegui una mappatura ad alta risoluzione in modalità statica all'interno di una griglia di cinque per cinque usando una dimensione di un micrometro, 0,2 secondi di esposizione per punto e potenza laser al 50%.

Successivamente, acquisire spettri dal substrato di grafene eseguendo le seguenti scansioni. Schermare gli spettri grezzi iniziali ed escludere quelli che mostrano rumore eccessivo o forme spettrali anomale. Applicare un filtro Savitsk-Golay a ogni spettro per ridurre il fondo di fluorescenza e levigare i dati spettrali.

Calcola il rapporto segnale/rumore per ogni spettro utilizzando il metodo picco/base o il metodo della deviazione standard. Per ogni spettro, calcola il rapporto segnale-rumore come il rapporto tra l'intensità di picco dopo la sottrazione di base in una banda Raman rappresentativa e la deviazione standard del rumore. Si stima il rumore sottraendo una versione smussata di Savitsky-Golay dello spettro, usando una finestra di dimensione 11 e un ordine polinomiale di tre dallo spettro originale.

Classificare tutti gli spettri in ordine crescente del rapporto segnale/rumore e valutare la persistenza dei picchi diagnostici attraverso gli spettri classificati per determinare la soglia. Poi imposta la soglia nel punto in cui uno qualsiasi di questi picchi scompare nel rumore di base, corrispondente a un rapporto segnale-rumore di 28. Escludere gli spettri che cadono al di sotto della soglia del rapporto segnale/rumore di 28 per garantire che solo spettri di alta qualità vengano mantenuti per l'analisi a valle.

E normalizzare ogni spettro rimanente fino alla sua massima intensità di picco o all'area totale sotto la curva. Assegna un'etichetta a ciascuna misurazione spettrale in base alla sua origine, come un paziente con cancro gastrico o un controllo sano. Inserire i dati spettrali etichettati in un classificatore a vettori di supporto con kernel lineare e applicare una divisione stratificata per una validazione incrociato a cinque volte per garantire una rappresentazione bilanciata in ogni piegatura.

Ora, si mediano le metriche di accuratezza su tutte le pieghe per valutare le prestazioni complessive del modello. Infine, utilizzare l'analisi discriminante lineare, o LDA, per ridurre la dimensionalità del dataset di scattering Raman potenziato dalla superficie per la visualizzazione. Impiegare il modello addestrato di analisi discriminante lineare per effettuare una classificazione diretta tra i gruppi campionari.

Gli spettri Raman con gli spettri medi corrispondenti hanno rivelato firme molecolari distinte in ogni tipo di campione acquisite da singole piccole vescicole extracellulari isolate da tessuti, sangue e saliva. L'analisi discriminante lineare ha rivelato un chiaro raggruppamento dei dati delle vescicole extracellulari in base al tessuto di origine, al sangue o alla saliva. La classificazione binaria tramite un classificatore a macchina a vettore di supporto raggiunge la massima accuratezza per campioni di tessuto al 90,1%, seguita dal sangue al 70,9% e saliva al 60,7%, suddivisioni di classificazione basate su LDA separano chiaramente i campioni sani da quelli di cancro gastrico nei dati di vescicole extracellulari derivati dal tessuto.

Divisioni simili di classificazione basate sull'LDA per dati di vescicole extracellulari derivati da sangue e saliva hanno mostrato una separazione meno ottimale tra campioni sani e tumorali. Gli spettri Raman di vescicole incubate con doxorubicina senza grafene hanno mostrato picchi costanti approssimativamente a 1.081, 1.206 e 1.440 centimetri inversi. Con il grafene, sono stati osservati un ulteriore picco D di circa 1.350 centimetri inversi e un picco G di circa 1.580 centimetri inversi che fungono da standard interni.

Il rapporto tra il picco di doxorubicina a 442 centimetri inversi e il picco di grafene G aumentava con concentrazioni più elevate di farmaci e tempi di incubazione più lunghi. Abbiamo stabilito un'impronta biochimica a una singola vescicola per distinguere le fonti di malattia che mostrano potenziale per una diagnosi precoce. Tre vantaggi chiave della nostra tecnica.

Primo, è altamente sensibile. Due, è non invasivo. e terzo, non richiede la lisi o la scomposizione fisica delle particelle.

In futuro, correleremo il profilo spettrale al profilo proteomico, il che, a sua volta, aiuterebbe a correlare il contenuto dell'esoma con funzioni specifiche, come la comunicazione cellulare e il trasporto.