Combinato Shuttle-Box Training con elettrofisiologiche Cortex registrazione e stimolazione come strumento per studiare percezione e apprendimento

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare e manipolare l'azione di massa neurale e le neurodinamiche durante l'apprendimento. Questo viene ottenuto innanzitutto impiantando array di microelettrodi che permettono una stimolazione e registrazione simultanea e specifica del sito dell'attività neuronale nella corteccia uditiva. Come secondo passaggio, gli animali impiantati vengono addestrati in una scatola shuttle a due compartimenti secondo un paradigma di tipo go/no-go, registrando nel contempo l'attività neuronale in corso nella corteccia uditiva e utilizzando la microstimolazione intracorticale per il condizionamento.

Successivamente, l'analisi del comportamento di apprendimento e dei modelli di attività spaziotemporali correlati all'apprendimento viene effettuata su base individuale per ogni prova, in modalità offline. I risultati mostrano come la microstimolazione corticale sito-specifica possa essere utilizzata per evocare modelli di attività spaziotemporali che permettono di caratterizzare stati cognitivi soggettivi interni. Questo metodo stabilisce quindi un collegamento tra i modelli di attività dei circuiti corticali e gli stati comportamentali osservati relativi all'apprendimento e alla percezione.

Le tecniche qui descritte dimostrano che non è solo possibile correlare singoli modelli di attività corticale a stati comportamentali e cognitivi definiti, ma che è anche possibile evocare, mediante stimolazione elettrica, percezioni definite che possono essere associate a diversi comportamenti. L'estensione di questi risultati punta allo sviluppo di sostituzioni neuroprotesiche per funzioni sensoriali perdute. Questo metodo può essere applicato anche ad altre specie di roditori, come ratti e topi.

Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà poiché sono necessarie esperienza e standard ben consolidati nella gestione e nell'addestramento degli animali per ottenere buoni risultati da questi esperimenti di apprendimento. Inizialmente vengono preparati degli array di elettrodi multicanale stimolatori, che successivamente vengono impiantati chirurgicamente nella corteccia uditiva. Come indicato nelle istruzioni riportate nella parte scritta del protocollo, il resto della procedura inizia solo dopo che gli animali si sono completamente ripresi dall'intervento chirurgico.

Gli array epidurali a superficie sono realizzati con filo d'acciaio inossidabile disposto in una matrice tre per sei con una distanza inter-elettrodica di circa 600 micrometri. Collegare l'amplificatore della testata all'apposito cavo di registrazione. Utilizzare un fascio di cavi sottili e flessibili rivestiti con una maglia metallica per proteggere il collegamento dai danni causati dal morso degli animali.

Utilizzare un preamplificatore all'interno della scatola schermata per aumentare il rapporto segnale-rumore e la banda passante. Filtrare il segnale nella gamma di frequenza desiderata per le registrazioni del potenziale di campo locale. Campionare i dati con una frequenza di campionamento superiore a un chilohertz e un filtro da due a 300 hertz. Per le registrazioni del potenziale d'azione, utilizzare una frequenza di campionamento di almeno 40 chilohertz e un filtro da 300 a 4.000 hertz.

Per iniziare il test comportamentale, utilizzare una scatola di trasferimento collocata all'interno di una camera schermata acusticamente ed elettricamente. La scatola contiene due compartimenti separati da un ostacolo. Utilizzare altezze dell'ostacolo adeguate alla specie specifica, poiché l'altezza dell'ostacolo influenza il bias comportamentale della risposta.

Dopo aver collegato l'animale da sottoporre al test al cavo di registrazione e stimolazione, posizionare delicatamente l'animale nella camera di addestramento e permettergli di abituarsi per tre minuti prima dell'inizio della sessione; registrare tutti i passaggi tra compartimenti durante la fase di abituamento. Controllare attentamente la qualità della registrazione prima dell'inizio dell'addestramento. Applicare un filtro online di trasformata di Fourier rapida al segnale per determinare l'ampiezza del rumore a 50 hertz.

Infine, verificare attentamente tutte le connessioni tra il connettore della testa, gli adattatori, gli stadi della testa, il cablaggio e gli amplificatori. Utilizzare uno stimolatore multicanale per applicare una stimolazione microcorticale agli elettrodi di stimolazione ai fini della stimolazione condizionata. Applicare lo stimolo condizionato e quindi applicare lo stimolo non condizionato sotto forma di scossa elettrica attraverso il pavimento a griglia, assicurandosi che l'intensità della scossa applicata sia avversiva, ma non dolorosa.

Come mostrato qui. Presentare prove vuote senza stimolo incondizionato e stimolo condizionato alternati tra le prove per correggere attraverso un comportamento sottile. Classificare un cambio di compartimento dopo l'inizio dello stimolo condizionato entro una finestra temporale critica di quattro secondi come risposta positiva.

Se una reazione condizionata non si verifica in risposta allo stimolo condizionato entro la finestra temporale critica, somministrare immediatamente una lieve scossa ai piedi per sei-dieci secondi. Come stimolo incondizionato, classificare questo evento come un mancato stimolo condizionato nei test negativi; un cambiamento di compartimento entro la finestra temporale critica viene classificato come risposta di allarme falso. Applicare lo stimolo incondizionato per un massimo di 10 secondi immediatamente dopo questa risposta condizionata inappropriata.

Non applicare lo stimolo incondizionato di scossa elettrica ai piedi dopo i trial negativi dello stimolo condizionato, quando l'animale rimane nel compartimento durante la finestra temporale critica. Classificare questo come rifiuto corretto dopo il completamento dell'intero esperimento. Controllare la posizione stabile dell'array di elettrodi di stimolazione, somministrando anestesia chirurgica e quindi applicando una corrente catartica monopolarità erogata attraverso tutti i canali di stimolazione per ottenere depositi di ferro nel tessuto nella posizione d'impianto. Determinare attentamente le latenze di fuga in tempo reale; aumentare gradualmente l'intensità della scossa elettrica ai piedi se le latenze di fuga superano i due secondi.

Dopo le prime 20 prove per analizzare i dati di addestramento, calcolare le frequenze di reazione condizionata per le prove con stimolo condizionato positivo e con stimolo condizionato negativo come mostrato nel grafico a schermo, rappresentando le frequenze di reazione condizionata in funzione della sessione o del blocco di prove per valutare l'andamento dell'addestramento e la dinamica dell'apprendimento. Infine, eseguire l'analisi del deep prime seguendo le istruzioni riportate nella parte scritta del protocollo. Un indice di sensibilità con il deep prime superiore a uno può essere utilizzato come criterio soglia per una discriminazione riuscita; le latenze di risposta durante le prove con stimolo condizionato positivo sono qui riportate per singole prove. Considerando tutte le sessioni di addestramento, tutte le risposte con latenze inferiori a secondi corrispondono a risposte corrette riuscite.

Gli istogrammi delle latenze di risposta sono bimodali, corrispondenti a risposte HIIT entro i sei secondi e risposte di fuga da sei a otto secondi. Questo è un esempio tipico di un potenziale evocato elettricamente o EEP da un singolo animale, mediato attraverso i trial con stimolo positivo in una singola sessione di addestramento; l'EEP è mostrato prima della rimozione degli artefatti del singolo stimolo in nero e dopo la rimozione degli artefatti in rosso. Il picco negativo precoce e prominente, noto come N due zero, è visibile a una latenza di 20 millisecondi.

Questa figura mostra un'ulteriore analisi delle distribuzioni spaziali dei due zeri di ampiezza di N in risposta a uno stimolo condizionante positivo all'elettrodo di stimolazione rostrale nel pannello superiore e a uno stimolo condizionante negativo all'elettrodo di stimolazione caudale. Nel pannello inferiore, si evidenzia la risoluzione spaziale degli stati evocati in tutta la corteccia uditiva. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che il collegamento a terra del pavimento a griglia è fondamentale per ottenere registrazioni elettrofisiologiche di alta qualità, nonché per una corretta somministrazione della stimolazione elettrica successivamente a questa procedura.

Altri metodi, come manipolazioni optogenetiche e farmacologiche, possono essere inclusi nel protocollo al fine di indagare specifici tipi cellulari e sistemi di trasmettitori nella circuitazione corticale durante la percezione e l'apprendimento. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori del settore, consentendo di passare da una semplice descrizione correlative a una descrizione più causale del ruolo della dinamica neuronale nelle funzioni di apprendimento e memoria.