Utilizzando la tomografia micro-computerizzata per la valutazione di sviluppo del tumore e follow-up di risposta al trattamento in un modello murino di cancro ai polmoni

L'obiettivo generale di questo video è identificare i vantaggi dell'utilizzo della Micro CT, per la valutazione dello sviluppo del tumore, della risposta al trattamento e di altri esperimenti in modelli murini di cancro al polmone. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro del polmone quando si utilizza un modello murino, come quando i tumori iniziano a crescere, il tasso di crescita e la risposta agli interventi terapeutici. Questa tecnica ci consente di identificare quali animali dovrebbero essere esclusi dal nostro studio, rilevando al contempo i cambiamenti in tempo reale nelle dimensioni del loro tumore.

La tecnica consente di risparmiare tempo e fatica e riduce notevolmente il numero di topi per gruppo di studio. Dallo scanner Micro-CT, accedere al controllo del computer e aprire il pacchetto software denominato RMCT2"Quindi, avviare il ciclo di riscaldamento. Quindi, preparare il piano campione dello scanner, per il mouse, avvolgendolo nella plastica.

Quindi, anestetizzare il topo usando isoflurano e confermare che è anestetizzato, usando un pizzico cutaneo. È sufficiente un pizzico delicato di una piccola piega della pelle. Successivamente, applicare un unguento oftalmico per prevenire la secchezza corneale.

Ora posiziona il topo, con la parte dorsale rivolta verso l'alto, sul letto del campione. Tieni la testa del mouse e tira il corpo verso il basso dagli arti inferiori per allungare e raddrizzare il corpo simmetricamente. Quindi, instradare il gas anestetico verso la camera e posizionare il tubo del gas vicino al naso dell'animale, per somministrare l'anestetico continuo.

Quindi, avvolgere il mouse e il letto di campionamento con della plastica, per mantenere il mouse in posizione. Assicurati che il mouse sia sicuro perché qualsiasi movimento o torsione durante la scansione risulterà in immagini sfocate e inutilizzabili. Ora, chiudi la camera, regola il sistema a 90 kilovolt e 160 micro-ampere e imposta il tempo di scansione a 4,5 minuti.

Impostare l'intervallo dell'immagine su 24 millimetri. Quindi, impostare il sistema in modalità sincrona per gli heartbeat. Ora, crea una nuova cartella nel database per le nuove immagini e avvia la scansione.

Dopo aver completato la scansione, sposta il mouse in una gabbia vuota e osservalo finché non riprende conoscenza. Non restituirlo ai suoi compagni di alloggio fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia. Aprire i file immagine micro CT seriali nell'immagine J.Scorrere tutte le immagini di ciascun mouse dal collo all'addome o viceversa.

Ora, utilizzando scansioni di topi selvatici naïve, identifica la densità di diverse aree e le normali strutture anatomiche nel torace. Scorrere verso l'alto fino ai visceri addominali biancastri e al diaframma e identificare l'area attraverso il torace e fino al collo. Prendi nota dei punti di riferimento ossei della gabbia toracica, dello sterno, delle vertebre e delle costole.

Quindi, identificare il cuore nella parte anteriore del torace e i principali vasi sanguigni vicino al cuore e nel mediastino. Il lume tracheale è un piccolo cerchio scuro a livello del collo e della parte superiore del torace, che si biforca nei bronchi principali destro e sinistro, per poi continuare a ramificarsi in bronchi sempre più piccoli. Si noti che ogni bronco è strettamente associato a due o tre vasi sanguigni.

Ora, inizia a esaminare le scansioni dei topi DT non indotti e identifica la presenza di eventuali anomalie. Escludere dall'esperimento tutti i topi con ombre polmonari anormali pre-induzione, come noduli o bolle enfisematose. Per questo esperimento, utilizzare topi con scansioni polmonari normali in grado di produrre tumori indotti da FGF9.

Per indurre i tumori, fornire doxiciclina nel loro cibo a 200 parti per milione. Dopo 10 settimane, eseguire una seconda scansione Micro-CT di questi topi per confermare lo sviluppo di noduli tumorali nei polmoni. Quindi, dividi i topi in due gruppi.

Somministrare il bloccante FGFR, AZD4547, a un gruppo tramite un sondino gastrico. Fallo per 6 giorni alla settimana per 10 settimane. Dai un placebo all'altro gruppo.

Segui i cambiamenti nelle ombre nodulari eseguendo una terza scansione da quattro a cinque settimane dopo l'inizio del trattamento. Successivamente, al termine del trattamento completo di 10 settimane, eseguire una quarta scansione. Quindi, identificare i cambiamenti dinamici nei noduli tumorali, in risposta al trattamento, confrontando posizioni simili all'interno delle immagini di scansione seriale nei diversi punti temporali.

Cerca la comparsa o la scomparsa di eventuali ombre anomale. Orientarsi correttamente nella stessa posizione anatomica è fondamentale per interpretare i risultati. Utilizzare punti di riferimento anatomici facilmente identificabili all'interno del torace, come la trachea, la sua biforcazione, i bronchi principali destro e sinistro, l'aorta e i grandi vasi sanguigni e il diaframma.

A causa delle inclinazioni del corpo, le ossa sono punti di riferimento meno utili. Dopo aver soppresso un topo e aver avuto accesso al suo collo e ai suoi polmoni, taglia via il cuore e la ghiandola del timo. Inserire una pinza dietro la trachea per separarla dall'esofago.

Successivamente, incannulare la trachea utilizzando una cannula G24 e fissare la cannula annodando una sutura posta attorno alla punta intertracheale. Ora, gonfiare e fissare il polmone utilizzando il 4% di PFA ghiacciato tramite la cannula con una colonna di 25 cm. Quindi, staccare la cannula e stringere il nodo sulla trachea per evitare perdite di PFA.

Ora, taglia la trachea superiore, compreso il suo attacco alla laringe. E mentre estrai la trachea dal filo di sutura, seziona la trachea e i polmoni da tutti gli attacchi. Quindi, rimuovere la trachea con i polmoni en blanc.

Metti i fazzoletti in un tubo da 15 ml contenente 5 ml di PFA al 4% a temperatura ambiente. Lasciare i polmoni in PFA durante la notte per una completa penetrazione e fissazione dei tessuti. Quindi, elabora il tessuto come al solito.

Nei topi DT di età compresa tra 8 e 12 settimane per questo studio, circa la metà ha mostrato anomalie polmonari nella scansione Micro-CT, rendendoli inadatti all'inclusione. Per lo studio, l'induzione del tumore è stata attivata per 10 settimane, seguita dal trattamento. I topi a cui è stato somministrato l'inibitore FGFR, AZD4547, per 10 settimane hanno mostrato la scomparsa o la riduzione delle dimensioni dei noduli visibili nelle scansioni pre-trattamento.

D'altra parte, i topi di controllo a cui è stato somministrato il placebo non hanno mostrato alcun cambiamento, un aumento delle dimensioni dei noduli e/o la comparsa di nuovi noduli. La valutazione istologica dei polmoni conferma l'accuratezza dei risultati ottenuti con la scansione Micro-CT. I topi giudicati con polmoni puliti, infatti, avevano un'istologia polmonare normale.

Considerando che, i topi che mostravano anomalie, mostravano vari cambiamenti istologici tra cui bolle e noduli. Dopo 10-12 settimane di induzione con doxiciclina, in tutti gli animali sono stati osservati noduli di adenocarcinoma multiplo, con dimensioni e posizioni variabili. Il successivo trattamento con 10-12 settimane di un bloccante FGFR, ha mostrato un numero inferiore e più piccolo di noduli.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la Micro-CT per valutare lo sviluppo del tumore nel polmone del topo. E per seguire eventuali cambiamenti in questi tumori, in risposta a varie procedure sperimentali. Una volta avviato il mouse, le scansioni possono essere eseguite in meno di 10 minuti per mouse.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere il mouse in anestesia profonda e di avvolgerlo saldamente nel letto del campione per ridurre al minimo il movimento durante le scansioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro del polmone e delle cellule staminali tumorali per esplorare l'entità dello sviluppo del tumore, la regressione progressiva e l'impostazione di diversi esperimenti. Non dimenticare che lavorare con i raggi X può essere pericoloso.

Nel funzionamento standard della macchina, le procedure devono essere sempre eseguite durante l'esecuzione di questa procedura.