Name: Utilizzando la tomografia micro-computerizzata per la valutazione di sviluppo del tumore e follow-up di risposta al trattamento in un modello murino di cancro ai polmoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Impara a utilizzare la micro-tomografia computerizzata per valutare lo sviluppo tumorale e la risposta al trattamento in modelli murini di adenocarcinoma polmonare. Questa tecnica consente il monitoraggio in tempo reale delle dimensioni dei noduli.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione-in-Aid da JSPS KAKENHI per AEH (Grant numero 25.461.196) e la tubercolosi (Numeri sovvenzione 23.390.218 e 15H04833) e National Institutes of Health sovvenzione HL111190 (DMO). Gli autori vorrebbero riconoscere Miyuki Yamamoto per i suoi sforzi per aiutare con la genotipizzazione degli animali e la preparazione di sezioni istologiche. Siamo grati alle Risorse ricerca in collaborazione, Facoltà di Medicina, Università di Keio per il supporto tecnico e reagenti.

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali di Keio University. Nota: In questo studio, abbiamo usato il Sftpc-rtTA e topi Tre-FGF9-IRES-EGFP DT in cui l&#39;adenocarcinoma del polmone si sviluppa rapidamente dopo l&#39;induzione alimentando Chow contenente doxiciclina 6,7. Tuttavia, tutte le procedure di valutazione possono essere applicati ad altri modelli murini cancro ai polmoni. 1. Esperimento Outline: <ol><li> Identificare lo stato dei polmoni alla linea di base: <ol><li> Prima di induzione di tumore, quando i topi DT sono 8 - 12 settimane di vita, eseguire la prima scansione micro-CT (vedere paragrafi 2 e 3). Questo serve come la scansione basale polmone, conferma l&#39;assenza di noduli spontaneamente sviluppate causati da un transgene che perde, e documentare l&#39;assenza di qualsiasi patologia polmonare esistente prima dell&#39;induzione del tumore. </li></ol></li><li> Avviare l&#39;induzione del tumore: <ol><li> Accendere i topi DT da ch regolareome doxiciclina chow per indurre Fibroblast Growth Factor (FGF) 9 espressione nelle cellule alveolari e di avviare lo sviluppo del tumore. Dare doxiciclina Chow (200 ppm) ad libitum. </li></ol></li><li> Confermare lo sviluppo di noduli tumorali nei polmoni del mouse: <ol><li> Eseguire una scansione micro-CT per identificare lo sviluppo dei noduli tumorali rispetto alla scansione pre-induzione. </li></ol></li><li> Valutare la risposta al trattamento: <ol><li> Per testare la capacità del micro-CT per rilevare variazioni di noduli tumorali in risposta al trattamento, amministrare il FGF Receptor (FGFR) inibitore AZD4547, quindi eseguire ulteriori scansioni micro-CT dopo 5 e 10 settimane. </li></ol></li><li> valutazione end-point: <ol><li> Euthanize tutti i mouse trattamento e di controllo e tessuti di processo per la valutazione istologica (vedi paragrafo 6). </li></ol></li></ol> 2. I topi Preparazione per Micro-CT Acquisizione di immagini: <ol><li> Accendere lo scanner micro-CT e il computer. </li><li> Click sul software denominato &quot;R_m CT2&quot;, quindi fare clic su &quot;warm up&quot;. </li><li> Rimuovere il letto campione su cui il mouse viene posizionato dalla camera micro-CT. Avvolgere il letto con pellicola trasparente. </li><li> Impostare la casella di induzione dell&#39;anestesia aggiungendo isoflurano al vaporizzatore anestesia fino al livello marcato. Impostare la portata isoflurano a 3 l / min. </li><li> Aprire il serbatoio di ossigeno per avviare il flusso di ossigeno nella casella induzione e impostare la portata a 1 L / min. </li><li> Posizionare il mouse nella casella di induzione di anestesia e confermare che è profondamente anestetizzati dall&#39;assenza di movimento spontaneo e in risposta a una presa pelle (una presa delicata di una piccola piega della pelle, che non causa danni ai tessuti o rottura della pelle). </li><li> Applicare un lubrificante oculare per prevenire la secchezza della cornea durante l&#39;anestesia. </li><li> Aprire la camera micro-CT e posizionare il mouse con il lato dorsale sul letto campione. Tenere la testa del mouse e tirare il corpo verso il basso dagli arti inferiori in order per allungare e raddrizzare il corpo in modo simmetrico. </li><li> Spegnere il flusso di anestesia per la casella di induzione e accenderlo verso il tubo che collega alla camera di micro-CT. </li><li> Posizionare il tubo di anestesia nel naso del mouse per gestire anestetico continuo. </li><li> Per fissare il mouse in posizione; avvolgere il mouse e il letto del campione con pellicola trasparente. Nota: E &#39;fondamentale per mantenere il mouse in anestesia profonda e avvolto al letto del campione perché qualsiasi leggero movimento o torsione del suo corpo durante la scansione si tradurrà in immagini nebulose e difficoltà di interpretazione. </li><li> Chiudere la camera di micro-CT. </li><li> Regolare il sistema di micro-CT a 90 kV e 160 μA e il tempo di scansione di 4,5 min. Impostare l&#39;intervallo di immagine da 24 × 19 mm e la dimensione voxel di 50 × 50 × 50 micron. Utilizzare la modalità sincrona per i battiti cardiaci. </li><li> Creare una nuova cartella nel &quot;Database&quot; al fine di salvare nuove immagini nella cartella. </li><li> Avviare la scansione. </li><li> Dopo il completamento della scansione, spostare il mouse in una gabbia vuota e osservare finché non riprende conoscenza. Non mettere con altri topi fino a quando non ha pienamente recuperato dagli effetti dell&#39;anestesia. </li></ol> 3. Pre-induzione Micro-CT visualizzazione di immagini e analisi: <ol><li> Per visualizzare le immagini di micro-CT, scaricare il software ImageJ gratuitamente dal seguente sito web: <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> . Nota: ogni file di dati micro-CT è una pila di circa 500 file TIF (.tif). Altri software di visualizzazione immagini può anche essere usato. </li><li> Aprire le micro-CT file di immagini seriali e scorrere tutte le immagini di ogni topo dal collo all&#39;addome o viceversa. </li><li> Usando scansioni di topi wild-type ingenui, individuare la densità delle diverse aree e strutture anatomiche normali al petto basata sulla conoscenza dell&#39;anatomia del mouse (vedere Figura 1A). <ol><li> Tenere il cursore con ilmouse del computer e scorrere verso l&#39;alto, a partire dai visceri addominali biancastra e il diaframma, attraverso il torace e fino al collo. </li><li> Identificare i punti di riferimento ossei gabbia toracica (sterno nella parte anteriore, vertebre nella parte posteriore e le costole ai lati). </li><li> Identificare cuore nella parte anteriore del petto e le principali vasi sanguigni vicino al cuore e nel mediastino. </li><li> Osservare lume trachea (come un piccolo cerchio nero a livello del collo e parte superiore del torace), che si biforca in destra e sinistra bronchi principali quindi continuano ad espandersi in bronchi più piccoli. Si noti che ogni bronchi è strettamente associata con due o tre vasi sanguigni (Figura 1A). </li></ol></li><li> Inizia esaminando le scansioni di topi DT non-indotta e identificare la presenza di eventuali anomalie. <ol><li> Escludere i topi con le ombre anomale pre-induzione del polmone (ad esempio, noduli, bolle enfisematosa, etc.) da qualsiasi ulteriori esperimenti. (Figura 1C-E, G, H </sTrong&gt;). </li></ol></li></ol> 4. Tumore induzione: <ol><li> Per indurre lo sviluppo del tumore nei topi sperimentale che ha mostrato normali scansioni polmonari, passa il loro cibo da chow chow regolare per doxiciclina contenenti (200 ppm). </li></ol> 5. Follow-up scansioni: <ol><li> Dopo 10 settimane, eseguire una seconda scansione micro-CT di tutti i topi per confermare lo sviluppo dei noduli tumorali nei polmoni (vedere Figura 2). </li><li> topi divisi in due gruppi. Somministrare la AZD4547 FGFR bloccante (125 mg / kg / die tramite un tubo gastrico per 6 giorni / settimana per 10 settimane) ad un gruppo e un placebo all&#39;altro gruppo di controllo per 10 settimane. </li><li> Seguire i cambiamenti nelle ombre nodulari eseguendo una terza scansione 4 - 5 settimane più tardi. </li><li> Alla fine di 10 settimane di trattamento, effettuare una quarta scansione. </li><li> Euthanize tutti i mouse con CO 2 inalazione o con iniezione intraperitoneale di 0,1 mg / 200 ml di pentobarbital. </li><li> Aidentificare i cambiamenti dinamici nei noduli tumorali dopo l&#39;induzione e in risposta al trattamento, identificare posizioni analoghe nelle immagini di scansione seriale dello stesso mouse su due o più punti di tempo quindi controllare per la comparsa / scomparsa di eventuali ombre anomale (Figura 3 ). </li><li> Per facilitare l&#39;identificazione di uno stesso piano nella stessa mouse diversi punti temporali, cercare di associare il piano di interesse con strutture anatomiche limite all&#39;interno del torace del mouse. <ol><li> Utilizzare punti di riferimento come ad esempio la trachea, la sua biforcazione, la destra e la sinistra bronchi principali, aorta, diaframma, e grandi vasi sanguigni. Nota: ossa del petto, tra le vertebre toraciche, le costole, e lo sterno sono meno utili come punti di riferimento di posizionamento a causa delle inclinazioni minori comuni in allineamento del corpo del mouse sul letto del campione, che aumentano la possibilità di errata interpretazione della posizione di scansione. Allo stesso modo, il numero di serie di immagini all&#39;interno del file di scansione è inaffidabile per identifying stessa posizione nel tempo a causa del cambiamento nel topo lunghezza del corpo da un time-punto ad un altro. La mancata o inesattezza nell&#39;identificare stesso piano in diversi momenti possono causare falsi / interpretazione negativa positiva dei risultati. </li></ol></li></ol> 6. mouse eutanasia e Collezione del polmone: <ol><li> Euthanize topi con CO 2 inalazione o con iniezione intraperitoneale di 0,1 mg / 200 ml di pentobarbital. </li><li> Esporre visceri addominali tagliando longitudinalmente attraverso la parete addominale. Bleed il mouse per ridurre il volume di sangue nei polmoni sezionando l&#39;aorta addominale. </li><li> Incidete il diaframma con le forbici sottili; questo comporta la perdita della pressione negativa dalla cavità toracica, crollare così i polmoni. Esporre i polmoni e il cuore, tagliando e rimuovendo parti delle costole della parete toracica anteriore. Pulire la parte frontale del collo tagliando i tessuti cutanei e molli per esporre la tracheaun. </li><li> Tagliare il cuore e timo. Inserire una pinza dietro la trachea per separarlo dal esofago. </li><li> Cannulate la trachea con una cannula G24 poi fissarlo in posizione stringendo un filo intorno alla parte inserita. </li><li> Gonfiare e fissare il polmone usando ghiacciata 4% paraformaldeide (PFA) attraverso la cannula tracheale usando una colonna 25 cm. Staccare la cannula e serrare il filo per evitare perdite PFA poi tagliare la trachea superiore fuori il suo attaccamento alla laringe. </li><li> Tirare la trachea dal filo di sutura e sezionare dal suo attacco, e continuare verso il basso per rimuoverlo con il polmone en -block. Inserire in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di 4% PFA. Lasciare i polmoni in PFA O / N per assicurare la penetrazione nei tessuti completa e la fissazione, quindi elaborare il tessuto in un blocco di paraffina standard di 8. </li><li> Tagliare i blocchi di paraffina in 6 fette um-spessi su un microtomo e macchia con ematossilina eosina utilizzando tecniche standard. </li></ol&gt; 7. istologica di valutazione: Nota: Sebbene l&#39;uso di un &quot;scanner slide&quot; per la valutazione istologica digitale è qui descritto, l&#39;uso di microscopi regolari e valutazione istologica visiva per valutazione è anche possibile. <ol><li> Accendere lo strumento scanner per diapositive e computer. </li><li> Fare clic sul software &quot;scansione NDP&quot;. </li><li> Selezionare la modalità di scansione &quot;Batch di diapositive&quot; e &quot;Semi-Auto Mode&quot; per la scansione di una serie di diapositive. Nota: Il braccio robotizzato che preleva i vetrini durante la scansione sequenziale è molto sensibile ad eventuali irregolarità sui bordi dei vetrini. </li><li> Palpare i bordi di tutti i vetrini prima di caricarli nella macchina. Se non vi è alcuna sporgenza della copertura in vetro o mezzo di montaggio secco, pulirlo con un cutter o un bisturi. </li><li> Caricare i vetrini in una cassetta di diapositive. Aprire lo sportello del campione e far scorrere la cassetta in posizione di &quot;uno&quot;;. Chiudi la porta. </li><li> Sul software per computer, dare brevi nomi descrittivi a tutte le diapositive nella loro posizione corrispondente nel cassetto quindi fare clic sul pulsante &quot;OK&quot;. </li><li> Selezionare la modalità profilo: &quot;Campo chiaro&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;Start batch&quot; per avviare la scansione provvisorio. Nota: Una volta che la macchina ha terminato la scansione di tutti i vetrini, il software rileva automaticamente le aree con tessuti su tutti gli scivoli e suggerire come una regione di interesse. </li><li> Se necessario, ridefinire la regione di interesse, tenendo premuto il tasto sinistro del mouse e tirare il confine regione. Nota: Definire eccessivamente grandi aree delle diapositive come le regioni di interesse si tradurrà in un tempo molto più lungo di scansione. </li><li> Una volta soddisfatti con le regioni di interesse su tutte le diapositive, cliccare su &quot;Scan&quot; per avviare la scansione tutte le diapositive. Nota: I file scansiti possono essere osservati in digitale in bassa e alta risoluzione, e le immagini possono essere esportate in formato JPEGFile. </li></ol>

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<li>Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview%3A+Engineering+transgenic+constructs+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview: Engineering transgenic constructs and mice.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19, Unit 19.10 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il metodo di micro-CT-based qui descritto per l&#39;identificazione in tempo reale delle anomalie polmonari e il monitoraggio dello sviluppo di noduli tumorali e la risposta al trattamento in modelli animali di cancro del polmone consentirà agli scienziati che stanno conducendo esperimenti correlati al cancro del polmone a pianificare in modo più esperimenti accurati ed efficienti, risparmiando tempo e risorse. Abbiamo usato precedentemente MRI per lo stesso scopo 6. La chiarezza della scansione e la soglia p...

Il cancro del polmone è la principale causa di morte per cancro in tutto il mondo 1. La ricerca sulla prevenzione, la diagnosi precoce e il trattamento del cancro del polmone è in corso in molti centri di ricerca in tutto il mondo 2,3. Sono stati sviluppati diversi modelli animali di cancro ai polmoni, e hanno dimostrato utile nello studio dei meccanismi della carcinogenesi del polmone e delle cellule di origine, per determinare la presenza di cellule staminali del cancro, e per esaminare varie strategie terapeutiche 4. Modelli anteriori invocati iniziazione del tumore cancerogeno-indotta in ceppi di topi sensibili 5. Lo sviluppo di eliminazione diretta e modelli di topi transgenici in cui il cancro del polmone si pone come risultato di lesioni genetiche appositamente manipolati ha sostanzialmente migliorato la nostra capacità di controllare l&#39;induzione del tumore e mimici diversi aspetti del cancro del polmone umano 4. Tuttavia, una sfida importante nell&#39;utilizzo di modelli animali di cancro ai polmoni è la mancanza di un metodo in tempo reale aiidentificare esattamente e monitorare l&#39;insorgenza e lo sviluppo di tumori nei polmoni del mouse e documentare qualsiasi ulteriore modifica nelle loro dimensioni, come la loro crescita continua o la riduzione in risposta ai trattamenti. Questo ha costretto i ricercatori a ricorrere a diversi tempo, fatica, e le tecniche di consumo di risorse per identificare i tumori e per valutare i loro risultati sperimentali. La presenza di intrinseca variazione inter-topo in risposta ad induzione tumorale richiede l&#39;uso di un gran numero di animali in ciascun gruppo sperimentale per ridurre la variabilità dei dati. L&#39;incapacità di valutare la crescita del tumore o di risposta al trattamento in tempo reale ha costretto i ricercatori a eutanasia ciecamente topi a più fusi punti in protocolli sperimentali prolungati per garantire che essi raccoglieranno i dati corretti, con conseguente spreco di risorse dai campioni raccolti in momenti che sono o troppo presto o troppo tardi. Nel presente studio, un metodo per sfruttare un piccolo animale micro-ctomografia omputed (micro-CT) scanner per rilevare e follow-up dei tumori polmonari nei topi viventi è introdotto. Abbiamo utilizzato il nostro recentemente descritto Sftpc-rtTA e Tre-FGF9-IRES-EGFP doppio transgenici (DT) i topi che si sviluppano rapidamente adenocarcinoma polmonare in seguito ad induzione con doxiciclina 6,7. L&#39;uso di micro-CT permette di (tra le altre cose) escludono topi con anomalie polmonari aberranti prima dell&#39;induzione, confermare lo sviluppo dei noduli tumorali nel polmone dopo induzione, e osservare i cambiamenti nel noduli tumorali in risposta a trattamenti sperimentali. End-point l&#39;eutanasia di topi e valutazione istologica ha confermato l&#39;esattezza della valutazione in tempo reale condotta con micro-CT. Riteniamo che questa tecnica aprirà la strada per condurre esperimenti meglio pianificate utilizzando modelli animali il cancro del polmone, mentre il risparmio di risorse preziose, accorciando il tempo di osservazione e aumentando la precisione e la comprensione dei risultati.

<table><tbody><tr><td>micro-raggi X&ndash; tomografia computerizzata</td><td>Rigaku</td><td>R_mCT2</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer RS Digital Pathology System</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>RS C10730</td><td></td></tr><tr><td>NDP.view2&nbsp; Software di visualizzazione</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>U12388-01</td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html</td></tr><tr><td>Vaporizzatore di isoflurano - Riempimento a imbuto</td><td>VETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Camera di induzione, 2 L&nbsp; W9.5 e tempi; D23 & volte; H9.5</td><td>VETEQUIP</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Mylan</td><td>ES2303-01</td><td></td></tr><tr><td>AZD 4547</td><td>LC Labratories</td><td>A-1088</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu</td><td>SOM02-YA1312</td><td></td></tr><tr><td>G24 cannula&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>SP-FS2419</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>SLC Giappone/PMI Nutrition International</td><td>5TP7</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software&nbsp;</td><td>Istituto Nazionale di Sanità</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Unguento veterinario Puralube (Lubrificante oculare)</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando la tomografia micro-computerizzata per la valutazione di sviluppo del tumore e follow-up di risposta al trattamento in un modello murino di cancro ai polmoni

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Il cancro ai polmoni è il cancro più letale al mondo. In tutto il mondo è in corso un'intensa ricerca per identificare nuove terapie per il cancro del polmone. Diversi modelli murini di cancro del polmone vengono utilizzati per studiare il meccanismo di sviluppo del cancro e per sperimentare varie strategie terapeutiche. Tuttavia, l'assenza di una tecnica in tempo reale per identificare lo sviluppo di noduli tumorali nei polmoni dei topi e per monitorare i cambiamenti nelle loro dimensioni in risposta a vari interventi sperimentali e terapeutici ostacola la capacità di ottenere una descrizione accurata del decorso della malattia e della sua risposta tempestiva ai trattamenti. In questo studio, viene descritto un metodo che utilizza uno scanner per tomografia micro-computerizzata (CT) per il rilevamento dello sviluppo di tumori polmonari in un modello murino di adenocarcinoma polmonare. Successivamente, dimostriamo che il follow-up mensile con micro-CT può identificare cambiamenti dinamici nel tumore polmonare, come la comparsa di noduli aggiuntivi, l'aumento delle dimensioni dei noduli precedentemente rilevati e la diminuzione delle dimensioni o della risoluzione completa dei noduli in risposta al trattamento. Infine, l'accuratezza di questo metodo di valutazione in tempo reale è stata confermata con la quantificazione istologica dell'end-point. Questa tecnica apre la strada alla pianificazione e alla conduzione di esperimenti più complessi su modelli animali di cancro al polmone e ci consente di comprendere meglio i meccanismi della cancerogenesi e gli effetti delle diverse modalità di trattamento, risparmiando tempo e risorse.

L&#39;identificazione di topi con anomalie polmonari è stata eseguita al basale. Prima di induzione di tumore, quando i topi erano DT 8 - 12 settimane di età, i polmoni di tutti i topi sono stati sottoposti a scansione con micro-CT. Sorprendentemente, circa il 50% dei topi hanno mostrato anomalie che ci hanno costretto a ritenere inadatte per l&#39;inclusione nel successivo studio. Queste anomalie sono state ombre nodulo-like, grande piccolo bolle enfisematosa singoli o multipli e / o lo...

Descriviamo un metodo per il rilevamento dello sviluppo del nodulo tumorale nei polmoni di un modello murino di adenocarcinoma utilizzando la micro-tomografia computerizzata e il suo utilizzo per monitorare i cambiamenti nelle dimensioni del nodulo nel tempo e in risposta al trattamento. L'accuratezza della valutazione è stata confermata con la quantificazione istologica end-point.

Utilizzando la tomografia micro-computerizzata per la valutazione di sviluppo del tumore e follow-up di risposta al trattamento in un modello murino di cancro ai polmoni

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

L'obiettivo generale di questo video è identificare i vantaggi dell'uso della Micro CT per la valutazione dello sviluppo tumorale, della risposta al trattamento e di altri esperimenti nei modelli murini di cancro del polmone. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del cancro del polmone quando si utilizzano modelli murini, come ad esempio quando i tumori iniziano a crescere, la velocità di crescita e la risposta a interventi terapeutici. Questa tecnica ci permette di identificare quali animali devono essere esclusi dal nostro studio, rilevando al contempo i cambiamenti in tempo reale nella dimensione del tumore.La tecnica permette di risparmiare tempo e fatica, e riduce notevolmente il numero di topi per gruppo di studio. Dallo scanner Micro-CT, accedere al computer di controllo e aprire il pacchetto software denominato RMCT2. Quindi, avviare il ciclo di preriscaldamento. Successivamente, preparare il letto del campione dello scanner per il topo avvolgendolo in plastica.Successivamente, anestetizzare il topo utilizzando isoflurano e confermare che sia anestetizzato, mediante una leggera pressione cutanea. È sufficiente una leggera pressione su una piccola piega di pelle. Successivamente, applicare un unguento oftalmico per prevenire la secchezza corneale.Ora posizionare il topo con il dorso rivolto verso l'alto sul piano del campione. Tenere la testa del topo e tirare il corpo verso il basso dalle estremità inferiori per allungare e raddrizzare simmetricamente il corpo. Quindi, indirizzare il gas anestetico nella camera e posizionare il tubo del gas accanto al naso dell'animale per somministrare un'anestesia continua.Quindi, avvolgere il mouse e il letto del campione con della pellicola di plastica, per mantenere il mouse fermo. Assicurarsi che il mouse sia ben posizionato, poiché qualsiasi movimento o torsione durante la scansione produrrà immagini sfocate e inutilizzabili. Ora, chiudere la camera, regolare il sistema a 90 kilo-volts e 160 micro-ampere, e impostare il tempo di scansione a 4,5 minuti.Impostare l'intervallo dell'immagine su 24 millimetri. Quindi, impostare il sistema in modalità sincrona per i battiti cardiaci. Creare ora una nuova cartella nel database per le nuove immagini e avviare la scansione.Dopo aver completato la scansione, spostare il mouse in una gabbia vuota e osservarlo finché non riprende conoscenza. Non reintrodurlo dai compagni di alloggio finché non si è completamente ripreso dall'anestesia. Aprire i file delle immagini micro-TC seriali in ImageJ. Scorrere tutte le immagini di ciascun mouse dal collo all'addome o viceversa.Ora, utilizzando le scansioni di topi selvatici naïve, identificare la densità delle diverse aree e delle strutture anatomiche normali nel torace. Scorrere verso l'alto fino alle viscere addominali di colore biancastro e al diaframma, e identificare le aree attraverso il torace, fino al collo. Osservare i punti di riferimento ossei della gabbia toracica, lo sterno, le vertebre e le costole.Quindi, identificare il cuore nella parte anteriore del torace e i principali vasi sanguigni vicini al cuore e nel mediastino. La luce tracheale è un piccolo cerchio scuro a livello del collo e del torace superiore, che si biforca nei bronchi principali destro e sinistro, per poi continuare a suddividersi in bronchi sempre più piccoli. Si noti che ciascun bronco è strettamente associato a due o tre vasi sanguigni.Ora, iniziare a esaminare le scansioni di topi DT non indotti e identificare la presenza di eventuali anomalie. Escludere dall'esperimento qualsiasi topo con ombre polmonari anomale pre-induzione, come noduli o bolle enfisematose. Per questo esperimento, utilizzare topi con scansioni polmonari normali che possano sviluppare tumori indotti da FGF9.Per indurre i tumori, somministrare la doxiciclina nel mangime a 200 parti per milione. Dopo 10 settimane, eseguire una seconda scansione micro-TC su questi topi per confermare lo sviluppo di noduli tumorali nei polmoni. Successivamente, dividere i topi in due gruppi.Somministrare l'inibitore FGFR, AZD4547, a un gruppo tramite sonda gastrica. Eseguire questa procedura per 6 giorni alla settimana per 10 settimane. Somministrare all'altro gruppo un placebo.Monitorare i cambiamenti nelle ombre nodulari eseguendo una terza scansione quattro o cinque settimane dopo l'inizio del trattamento. Successivamente, alla fine del trattamento completo di 10 settimane, eseguire una quarta scansione. Quindi, identificare i cambiamenti dinamici nei noduli tumorali, in risposta al trattamento, confrontando posizioni simili all'interno delle immagini seriali delle scansioni nei diversi momenti temporali.Cercare l'insorgenza o la scomparsa di ombre anomale. È fondamentale orientarsi correttamente nella stessa posizione anatomica per interpretare correttamente i risultati. Utilizzare punti di riferimento anatomici facilmente identificabili all'interno del torace, come la trachea, la sua biforcazione, i bronchi principali destro e sinistro, l'aorta e i vasi sanguigni di grandi dimensioni, e il diaframma.A causa delle inclinazioni del corpo, le ossa sono punti di riferimento meno utili. Dopo aver soppresso un topo ed esposto il collo e i polmoni, rimuovere il cuore e la ghiandola timica. Inserire la pinzetta dietro alla trachea per separarla dall'esofago.Successivamente, cannuccia la trachea utilizzando una cannula G24 e fissa la cannula annodando un punto di sutura intorno alla punta inter-tracheale. Ora, gonfia e fissa il polmone utilizzando PFA al 4% freddo di ghiaccio tramite la cannula con una colonna di 25 cm. Quindi, rimuovi la cannula e serra il nodo sulla trachea per prevenire perdite di PFA.Ora, recidere la parte superiore della trachea, compresa la sua inserzione alla laringe. E, mentre si estrae la trachea dal filo di sutura, dissezionare la trachea e i polmoni da tutti i legamenti di fissazione. Quindi, rimuovere la trachea con i polmoni en bloc.Posizionare i tessuti in un tubo da 15 ml contenente 5 ml di PFA al 4% a temperatura ambiente. Lasciare i polmoni in PFA tutta la notte per consentire una completa penetrazione e fissazione del tessuto. Successivamente, processare il tessuto secondo le procedure abituali.Nella fase di preselezione di topi DT di 8-12 settimane per questo studio, circa la metà presentava anomalie polmonari nell'analisi con micro-TC, risultando quindi inadatti all'inclusione. Per lo studio, l'induzione tumorale è stata attivata per 10 settimane, seguita dal trattamento. I topi ai quali è stato somministrato l'inibitore dell'FGFR, AZD4547, per 10 settimane hanno mostrato la scomparsa o la riduzione delle dimensioni di noduli precedentemente visibili negli scansioni pre-trattamento.D'altra parte, i topi di controllo trattati con placebo hanno mostrato o nessun cambiamento, o un aumento delle dimensioni dei noduli e/o la comparsa di nuovi noduli. La valutazione istologica finale dei polmoni conferma l'accuratezza dei risultati ottenuti con la scansione micro-TC. I topi giudicati avere polmoni chiari, in effetti, presentavano un'istologia polmonare normale.Nei topi che presentavano anomalie, si osservavano diversi cambiamenti istologici, tra cui bolle e noduli. Dopo 10-12 settimane di induzione con doxiciclina, in tutti gli animali furono osservati multipli noduli di adenocarcinoma, di dimensioni e posizioni variabili. Un successivo trattamento con un inibitore dell'FGFR per 10-12 settimane determinò una riduzione nel numero e nelle dimensioni dei noduli.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la Micro-TC per valutare lo sviluppo del tumore nel polmone del topo. E di come monitorare eventuali modifiche a questi tumori in risposta a diverse procedure sperimentali. Una volta avviati, le scansioni nei topi possono essere eseguite in meno di 10 minuti per topo.Nel corso di questa procedura, è fondamentale mantenere il topo in anestesia profonda e fissarlo saldamente al lettino del campione per ridurre al minimo i movimenti durante le scansioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro polmonare e delle cellule staminali tumorali, consentendo di esplorare l'estensione dello sviluppo tumorale, la regressione progressiva e l'impostazione di diversi esperimenti. Non dimenticare che lavorare con i raggi X può essere pericoloso.Nelle procedure standard di esecuzione della macchina devono sempre essere adottate precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.

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