Name: LAssemblea e lapplicazione di Shear Anelli : A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri come assemblare gli shear rings per studiare la fisiologia delle cellule endoteliali sotto stress da taglio fluido periodico. Questo metodo semplice ed economico permette di ottenere elevate repliche cellulari per valutare le risposte meccaniche in vitro.

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Gli autori vorrebbero riconoscere l&#39;aiuto di Mr. Christopher Nguyen, Aaron Hunter e la Shreveport Jumpstart, SMART, e programmi di formazione Biostart così come il reparto Centenario College of Louisiana di Biofisica, Shreveport, LA.

1. Costruzione di 150 mm di diametro Shear anelli (Figura 1) NOTA: anelli di taglio possono essere costruiti per creare molteplici dimensioni variando le dimensioni della parabola Petri esterne ed interne, con conseguente dispositivi con diverse superfici totali, rese cellulari e sviluppato gamme di forze di taglio. Questo rapporto descrive un piatto 150 millimetri combinato con un interno piatto 100 mm per una superficie totale 98 cm 2 (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig1.jpg" /> Figura assemblaggio ring 1. Shear. La parte superiore della figura mostra un anello di taglio parzialmente assemblato. Iniettare 0,5 ml di cloruro di metilene attraverso il foro 3 mm con una pipetta di trasferimento se una tenuta non è completamente formato tra i piatti interni ed esterni. L&#39;anello di taglio è sigillata chiusa mediante l&#39;applicazione di un cordone di 1 millimetro di spessore di adesivo di gomma di silicone intorno alla EDG internoe della parte superiore dell&#39;anello di taglio. La porzione inferiore della figura mostra l&#39;anello di taglio montato. Il blu rappresenta l&#39;area delle cellule endoteliali placcato. Le frecce rosse esterne ed interne indicano il moto orbitale dell&#39;anello di taglio e dei media all&#39;interno dell&#39;anello di taglio quando sono immessi su un agitatore orbitale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig2.jpg" /> Figura 2. misure di superficie per un anello di taglio 150 mm (non in scala). Pannello superiore mostra lo spostamento centrifugo di liquido verso l&#39;anello esterno in risposta alla rotazione orbitale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Creare un modello di costruzione anello di taglio generando un150 millimetri profilo bordo esterno in software di presentazione con un diametro interno di 100 mm posto al centro del cerchio 150 mm. Stampa il modello su un foglio di carta bianca formato A4. </li><li> Pipettare 10 ml di cloruro di metilene (diclorometano) in un 150 millimetri piatto di vetro Petri. E &#39;fondamentale che il piatto è di vetro e non in polistirolo (o altro materiale plastico vinile), il cloruro di metilene solubilizza maggior parte della plastica e viene qui utilizzato per unire componenti in plastica. ATTENZIONE: Utilizzare guanti per tutte le costruzioni con adeguata ventilazione cappuccio. Il cloruro di metilene è un irritante contatto ed è epatotossici. </li><li> Allineare di 150 mm piatto di plastica Petri sul modello di anello di taglio esterno. </li><li> Praticare un foro 3 mm al centro di un piatto 100 millimetri con un utensile rotante. Rimuovere eventuali trucioli di plastica prodotta dalla perforazione. </li><li> Tenendo con una mano guantata, invertire e immergere il bordo superiore della piastra Petri 100 mm dal passaggio precedente nel pool di cloruro di metilene per circa 3 sec. </li><li> Transfer il &quot;bagnare&quot; 100 millimetri piatto edge-down sul centro di un piatto 150 mm, facendo attenzione ad allineare il piatto 100 millimetri sul modello marcato. Il cloruro di metilene viene fondere la plastica, unendo i piatti da 100 mm e 150 mm. Ruotare delicatamente il piatto 100 millimetri in senso orario e antiorario alcune volte per assicurare una buona adesione al piatto 150 mm. NOTA: Prestare la massima attenzione per garantire il corretto allineamento del piatto interno al centro del piatto esterno. allineamento eccentrico può provocare variazioni della tensione di taglio in diversi punti del anello di taglio. Fare attenzione a non permettere cloruro di metilene a gocciolare accidentalmente sulla porzione pista esterna del piatto 150 millimetri Petri durante il posizionamento del piatto a 100 mm. Ciò fondere la plastica sulla superficie inferiore in cui le cellule saranno crescita, creando una superficie irregolare che può causare disturbi di flusso. </li><li> Una volta che il cloruro di metilene è asciugato, capovolgere i piatti appena associato Petri sopra e controllare attentamente i punti di contatto per assicurare cheuna tenuta stagna è formata tra le due piastre di Petri. </li><li> Se una tenuta non è completamente formato, iniettare 0,5 ml di cloruro di metilene attraverso il foro 3 mm con una pipetta. Sollevare il piatto e ruotare delicatamente per consentire al cloruro di metilene per raggiungere il bordo. NOTA: Se ruotato troppo rapidamente, il cloruro di metilene può versare nella porzione esterna del piatto 150 mm, deformando la superficie in cui le cellule crescono e rovinando l&#39;anello di taglio. Perdite anelli di taglio deve essere eliminata. </li><li> Sigillare il foro nel piatto 100 millimetri applicando un cordone 3 mm sigillante gomma siliconica. </li><li> Utilizzando un utensile rotante dotato di una testa di taglio piatta, tagliare la parte top 3 cm di un tubo coltura tissutale polistirene 15 ml conica, lasciando almeno 1 cm del tubo sotto il tappo. Lucidatura del bordo del tubo tagliato fino liscia e piatta con la parte piatta della testa di taglio. Rimuovere eventuali trucioli di plastica prodotte dalla macinazione. </li><li> Tracciare le tagliate tubo da 15 ml sulcoperchio del piatto 150 mm con un marcatore, circa 0,5 cm dal bordo del piatto. Eseguire un foro all&#39;interno del cerchio disegnato, con un margine di circa 1-2 mm dal bordo del cerchio. </li><li> Posizionare la parte superiore del tubo conico tagliato sopra il foro. Usando una pipetta, applicare circa 250 ml di cloruro di metilene ai bordi di taglio del tubo conico di impegnare il tubo conico al coperchio 150 mm. </li><li> Sigillare il coperchio 150 millimetri sul piatto 150 millimetri applicando 1 mm di spessore perlina di sigillante gomma siliconica intorno al bordo interno della parte superiore piastra Petri. </li></ol> 2. Sterilizzazione dei Shear Anelli <ol><li> Pipettare circa 10 ml di soluzione salina tamponata di fosfato nel ring taglio di nuova formazione attraverso la porta di conica tubo da 15 ml. Turbinano intorno a rimuovere i detriti all&#39;interno dell&#39;anello di taglio. Rimuovere il tampone fosfato con un aspiratore pipetta / vuoto Pasteur. </li><li> Ripetere il passaggio precedente fino a quando i detriti viene rimosso. </li><li> per sterilize l&#39;anello di taglio, utilizzare una combinazione di un risciacquo etanolo al 70% con irradiazione UV. <ol><li> Svitare il tappo sfiato, pipetta circa 10 ml di etanolo al 70% attraverso la porta di accesso, e avvitare il tappo. Ruotare e capovolgere sopra l&#39;anello di taglio più volte, in modo che l&#39;interno dell&#39;anello di taglio è accuratamente lavato. </li><li> Sotto una cappa aspirante, aspirare in eccesso il 70% di etanolo. Con un flacone spray, accuratamente spruzzare il foro del tappo e l&#39;accesso con il 70% di etanolo. </li><li> Posizionare l&#39;anello di taglio e il tappo sotto radiazione UV all&#39;interno della cappa di coltura di tessuti fino a completa asciugatura. </li></ol></li><li> Una volta asciutto, avvitare il tappo e memorizzare sterilizzato anelli di taglio a temperatura ambiente fino al momento in placcatura coltura cellulare. </li></ol> 3. Studi sforzo di taglio <ol><li> Piatto cellule endoteliali in anelli di taglio sterilizzati secondo il protocollo standard di coltura cellulare in genere utilizzando un rapporto 1: 4 di divisione per linee cellulari endoteliali trasformate. NOTA: Ratto microV retinacellule endoteliali ascular stati ottenuti commercialmente. cellule endoteliali del cervello umano (hCMEC / D3), le cellule sono state fornite come un dono generoso da Dr. Pierre-Oliver Couraud (Inserm, Francia) sono state coltivate in terreno di base endoteliale completa (EBM). </li><li> Consentire culture per raggiungere confluenza prima di iniziare gli studi di flusso. Utilizzare 30 ml di terreni di coltura tissutale (10% di siero fetale bovino, media di Dulbecco modificato Eagle con 1% di penicillina / streptomicina / amfotericina). Cambiare mezzo di coltura cellulare ogni 3 giorni e mantenere le cellule a 37 ° C con 7,5% di CO 2 e 92,5% camera d&#39;aria. </li><li> Posizionare il agitatore orbitale nell&#39;incubatrice. Nota: Shaker orbitali sono tipicamente pesanti (&gt; 10 kg). Posizionare il agitatore orbitale sul piano di fondo dell&#39;incubatore per ridurre al minimo lo stress mensola e vibrazioni. </li><li> Posizionare gli anelli di taglio sperimentale sul agitatore orbitale. Posizionare gli anelli gruppo di controllo taglio statico all&#39;interno dello stesso incubatore. </li><li> Stimare la sollecitazione massima di taglio all&#39;interno del shanello di orecchio con l&#39;equazione <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq1.jpg" /> dove <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> è il raggio di rotazione per l&#39;agitatore orbitale (in cm), <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" /> è la viscosità del mezzo (in poise), <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq4.jpg" /> è la densità del fluido (in g / ml), e <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" /> è la frequenza di rotazione (in rotazione / sec) 24. </li><li> Avviare l&#39;impostazione di rotazione sul agitatore orbitale al numero di giri desiderato (ad esempio, 90 rpm), lasciando gli anelli di taglio sul shaker per la durata desiderata di applicazione sollecitazione di taglio (ad esempio, 72 hr). NOTA: Shaker orbitali possono produrre calore, per cui la temperatura dell&#39;incubatrice deve essere monitorata inizialmente per garantire 37 ° C viene mantenuta per tutta la durata dell&#39;esperimento. Alternativamente, sanelli intendere possono essere trasferiti nelle camere ambientali (ad esempio, da camera incubatore modulare) e poi posto all&#39;interno di un incubatore di rotazione. </li><li> Dopo strati di cellule sono stati esposti al taglio per il tempo desiderato, rimuovere gli anelli di taglio dal termostato. Estrarre il coperchio anello di taglio e recuperare cellule e / o supporti per l&#39;esame finale desiderato analisi (ad esempio, Western blotting, fluorescenza attivato l&#39;ordinamento delle cellule, ecc) 25. </li></ol>

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J. Winny Yun ha un assegno di ricerca della fondazione Annette Funicello. J. Steven Alexander ha il supporto di ricerca del Dipartimento di Neurologia, LSUHSC-S.

La costruzione del sistema ad anello di taglio per esporre le cellule endoteliali al taglio è un approccio semplice per eseguire studi shear stress. Tuttavia, ci sono alcuni punti che sono fondamentali per l&#39;ottenimento di anelli di taglio superiore e risultati migliori. Un sigillo completo dovrebbe essere fatta tra l&#39;anello interno ed esterno per evitare che i supporti da perdite che potrebbe creare incoerente sforzo di taglio tra i campioni. Se una tenuta completa non è fatto, una quantità minima di cloruro di...

Fluid shear stress ha dimostrato di modulare i programmi genetici endoteliali 1-5 mediante l&#39;attivazione di elementi cis-normativo 6, istone acetiltransferasi attività 7 e gli elementi di risposta allo stress di taglio (SSRE) 8. Sforzo di taglio influenze contributi endoteliali verso la coagulazione modulando fattore tissutale 9 e attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) 10 espressione. Shear stress influenza anche il controllo dell&#39;angiogenesi 11 e il rimodellamento nave regolando la sintesi PDGF-B e la reattività 8. Il endoteliale derivate mediatori vasoattivi adrenomedullin, endotelina-1, urotensina II e relaxina sono disciplinate anche da taglio 12. Trascrizione di produzione di ossido nitrico sintasi endoteliale e la produzione di ossido nitrico sono entrambi di taglio dipendono 10. Shear controlla anche endoteliale ICAM-1 13. shear stress indotto dal flusso può quindi powerfully influenzare una grande varietà di risposte endoteliali. È importante sottolineare che, pulsazioni vascolari ora appaiono anche a svolgere ruoli importanti nella fisiopatologia di entrambi invecchiamento vascolare normale e forme di demenza vascolare 14 e può anche contribuire ad altre malattie neurodegenerative, come la sclerosi multipla 15. Tibiali e cellule endoteliali delle arterie sono intrinsecamente esposti a diversi modelli di flusso emodinamici in vivo, e molti fenotipi di cellule endoteliali diversi possono essere esposti 16. A seconda della grandezza e la periodicità di flusso, gli effetti sulle cellule endoteliali possono includere l&#39;attivazione delle cellule infiammatorie e l&#39;apoptosi, che possono riflettere i cambiamenti nei geni o proteine espressione 17,18. Studi sulla risposte delle cellule endoteliali a tranciare fenomeni pertanto restano complicate dalle difficoltà nella produzione di modelli in vitro che producono in modo adeguato tali modelli di taglio. Molti experime diversoprotocolli ntale sono stati sviluppati per applicare fluido shear stress endoteliale monostrati di cellule. Uno dei sistemi più utilizzati è la camera di flusso a piatti paralleli, che crea flusso laminare uniforme all&#39;interno della camera 19 - 21. Una pompa peristaltica è tipicamente collegato per creare flusso periodico, che può ricapitolare caratteristiche di flusso tipiche di molti luoghi in vivo 22. Un&#39;altra comune set-up utilizza il modello &#39;cono e piatto&#39;, dove il fluido sollecitazione di taglio viene determinata dalla velocità di rotazione del cono 23. Entrambi i sistemi, e altre intese simili a loro, può essere noioso per impostare e richiedono componenti che possono essere relativamente costosi e inaccessibili a molti laboratori. Un&#39;altra importante limitazione di questi modelli attuali è il numero relativamente basso di studi ripetute che possono essere eseguite contemporaneamente, ciascuno con un&#39;area superficiale relativamente bassa. Questo aumenta il tempo e co<html> mplexity di tali approcci. Pertanto, un modello ideale che induce shear unidirezionale e periodica potrebbe essere quella in cui un elevato numero di repliche di studio può essere facilmente impostato, ciascuno con una relativamente grande superficie. Inoltre, i modelli di cui sopra richiedono una messa a punto abbastanza sofisticato, che può essere un costo proibitivo per molti utenti. Un modello che può produrre disturbi di taglio dei fluidi utilizzando materiali di laboratorio di base potrebbe avere diversi vantaggi. Un metodo semplice e altamente economico dell&#39;applicazione unidirezionale, giornali sollecitazione di taglio comporta il posizionamento dei piatti circolari in un agitatore orbitale 24. Questo protocollo è molto semplice e può essere scalata fino a raggiungere elevati numeri di studio replicano, ciascuno con una relativamente grande superficie, come necessario. Tuttavia, le cellule situato nel centro del piatto sono esposti a diversi schemi di flusso di celle lungo la periferia, cedendo misti risposte fenotipiche cellulari nello stesso piatto. _content &quot;&gt; In questo rapporto attuale, si descrive la costruzione e l&#39;utilizzo di &#39;anelli di taglio&#39;, il nostro modello per la creazione di unidirezionale e periodica sforzo di taglio. Il progetto per l&#39;anello di taglio in modo efficace&quot; misti &quot;fenotipi di taglio indotta cellulari limiti limitando il flusso percorso all&#39;interno di un piatto di coltura circolare alla periferia attraverso il posizionamento di un anello interno. la costruzione e il funzionamento dell&#39;anello di taglio è semplice ed economico e può essere facilmente scalabile per soddisfare una vasta gamma di agitatori orbitali utilizzando ampiamente disponibili forniture di coltura tissutale. Questo modello può essere applicato in esperimenti di cellule endoteliali di fornire modelli di flusso unidirezionali e periodici ai livelli fisiologici e patofisiologici.

<table><tbody><tr><td>Piastra per coltura tissutale in plastica 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Le piastre devono essere in polistirene</td></tr><tr><td>150 x 25 mm Piastra per coltura tissutale in plastica</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Le piastre devono essere in polistirene</td></tr><tr><td>Piastra Petri in vetro da 150 mm</td><td>Fisher</td><td>3160150BO</td><td></td></tr><tr><td>Provette in plastica per coltura tissutale in polistirene da 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di metilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>sigillante in gomma siliconica</td><td>DAP</td><td>7079808641</td><td></td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento da 3 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>stampante carta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forbici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>utensile rotante e set</td><td>Dremel</td><td>4000-6/50</td><td></td></tr><tr><td>testa di taglio per utensile rotante</td><td>Dremel</td><td>EZ476</td><td></td></tr><tr><td>testa di foratura</td><td></td><td></td><td></td>per utensile</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> rotante acqua <tr><td>distillata agitatore orbitale</td><td>VWR</td><td>57018-754</td><td></td></tr><tr><td>incubatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali microvascolari retiniche di ratto</td><td>Cell Biologics</td><td>RA-6065</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;assemblea e l&#39;applicazione di &quot;shear anelli &#39;: a novel endoteliale modello per orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviazioni da livelli normali e modelli di fluidi vascolari gioco di taglio ruolo importante nella fisiologia vascolare e fisiopatologia inducendo adattivo così come i cambiamenti patologici nel fenotipo endoteliale e l&#39;espressione genica. In particolare, gli effetti disadattivi di periodico, flusso unidirezionale shear stress indotto possono innescare una varietà di effetti sui diversi tipi di cellule vascolari, in particolare le cellule endoteliali. Mentre ormai cellule endoteliali da diverse origini anatomiche sono state coltivate e approfondita analisi delle loro risposte al taglio fluido sono stati ostacolati dalla relativa complessità dei modelli di taglio (ad esempio, camera di flusso piatto parallelo, cono e modello di flusso piatto). Anche se questi rappresentano tutti ottimi approcci, tali modelli sono tecnicamente complessi e soffrono di svantaggi, tra cui i tempi di configurazione relativamente lungo e complesso, superfici basse, i requisiti per pompe e pressurizzazione spesso necessitano di sigillanti e guarnizioni, creando sfide per Both mantenimento di sterilità e l&#39;incapacità di eseguire più esperimenti. Tuttavia, se più elevati di throughput modelli di flusso e taglio erano disponibili, maggiori progressi sulle risposte di taglio endoteliali vascolari, la ricerca di taglio particolare periodico a livello molecolare, potrebbe essere più rapida avanzata. Qui, descriviamo la costruzione e l&#39;uso di anelli di taglio: un romanzo, semplice da montare, e poco costoso modello di coltura tissutale con un relativamente grande superficie che permette facilmente di un elevato numero di repliche sperimentali in unidirezionali, taglio periodico studi di stress su cellule endoteliali.

Qui vi presentiamo i risultati rappresentativi sia hCMEC / D3 cellule endoteliali del cervello e della retina di ratto monostrati di cellule endoteliali microvascolari, coltivate in anelli di taglio. Dopo aver lasciato monostrati di cellule endoteliali cerebrali hCMEC / D3 a crescere a confluenza in completa EBM, gli anelli di taglio sono stati posti su un agitatore orbitale per 72 ore. Usando l&#39;equazione dal punto 3.5, il...

Diversi livelli e modelli di taglio del fluido sono noti per modulare l'espressione genica endoteliale, il fenotipo e la suscettibilità alle malattie. Discutiamo l'assemblaggio e l'uso degli "anelli di taglio": un modello che produce modelli di sollecitazione di taglio unidirezionali e periodici. Gli anelli di taglio sono semplici da assemblare, economici e possono produrre elevate rese delle celle.

L&#39;Assemblea e l&#39;applicazione di &quot;Shear Anelli &#39;: A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

L'obiettivo generale di questo modello è creare un metodo semplice ed economico per lo studio del flusso periodico di fluidi e dello stress di taglio su cellule endoteliali in vitro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della fisiologia delle cellule endoteliali, ad esempio in che modo lo stress di taglio periodico influisce sulla forma, sulla struttura e sul funzionamento delle cellule endoteliali.Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un dispositivo per colture cellulari facilmente assemblabile, che fornisce ampie superfici per la valutazione delle risposte cellulari. A illustrare questa procedura sarà il signor Luke White, uno studente di medicina del mio laboratorio. Iniziare la procedura utilizzando un software di presentazione per creare un modello di costruzione dell'anello di taglio con un profilo esterno di 150 millimetri e un diametro interno di 100 millimetri posizionato al centro del cerchio di 150 millimetri.Stampare il modello su un foglio di carta bianca formato A4. Lavorando sotto cappa con ventilazione adeguata e indossando guanti, pipettare 10 millimetri di cloruro di metilene in una piastra di Petri di vetro da 150 millimetri. È fondamentale che la piastra sia di vetro poiché il cloruro di metilene solubilizza la maggior parte delle materie plastiche.Allinea una piastra di Petri in plastica da 150 millimetri al modello esterno di taglio. Utilizza uno strumento rotante per praticare un foro da 3 millimetri al centro di una piastra da 100 millimetri. Rimuovi tutti i trucioli di plastica prodotti durante la foratura.Tenendo con una mano guantata la piastra di Petri da 100 millimetri, capovolgerla e immergere il bordo superiore nella pozzetta di cloruro di metilene per circa tre secondi. Lasciare che l'eccesso di cloruro di metilene coli dalla piastra da 100 millimetri, quindi trasferire rapidamente la piastra, con il bordo bagnato rivolto verso il basso, al centro della piastra da 150 millimetri. Allineare con attenzione la piastra da 100 millimetri sulla sagoma segnata.Ruotare delicatamente la piastra da 100 millimetri in senso orario e antiorario alcune volte per assicurare un'adeguata adesione alla piastra da 150 millimetri. Una volta che il cloruro di metilene si è asciugato, capovolgere le piastre di Petri appena unite e ispezionare attentamente i punti di contatto. Se non si è formato completamente un sigillo stretto, iniettare 0,5 millilitri di cloruro di metilene attraverso il foro da 3 millimetri con una pipetta di trasferimento.Prendere la piastra e ruotarla delicatamente per permettere al cloruro di metilene di raggiungere il bordo. Dopo aver verificato che sia stato formato un sigillo stretto tra le due piastre di Petri, sigillare il foro nella piastra da 100 millimetri applicando un cordone di 3 millimetri di sigillante in gomma siliconica. Utilizzando uno strumento rotante dotato di una testa di taglio piatta, tagliare la parte superiore da 3 centimetri di un tubo in polistirene per coltura cellulare conico da 15 millimetri, lasciando almeno un centimetro di tubo sotto il tappo.Utilizzare il lato piatto della testa di taglio per levigare il bordo del tubo tagliato fino a renderlo liscio e piano. Rimuovere tutti i trucioli di plastica prodotti dalla levigatura. Con un pennarello, tracciare sul coperchio della piastra da 150 millimetri il contorno del tubo conico da 15 millilitri tagliato, posizionandolo approssimativamente a 0,5 centimetri dal bordo della piastra.Praticare un foro all'interno del cerchio disegnato, lasciando un margine di circa uno o due millimetri dal bordo del cerchio. Posizionare la parte superiore del tubo conico tagliata sul foro praticato. Utilizzando una pipetta trasferire circa un quarto di millilitro, ovvero 250 microlitri, di cloruro di metilene sui bordi tagliati del tubo conico per fissare il tubo alla coperchio da 150 millimetri.Infine, sigillare il coperchio da 150 millimetri alla piastra da 150 millimetri applicando un cordone di sigillante in gomma siliconica spesso un millimetro lungo il bordo interno della piastra di Petri superiore. Viene mostrato uno schema di un anello di sigillatura assemblato. Il colore blu rappresenta l'area delle cellule endoteliali seminate.Le frecce rosse esterne e interne indicano il movimento orbitale dell'anello di taglio e del materiale all'interno dell'anello di taglio quando viene posizionato su un agitatore orbitale. Preparare la sterilizzazione pipettando circa 10 millimetri di PBS nell'anello di taglio appena formato, attraverso il portello del tubo conico da 15 millilitri. Ruotare delicatamente per rimuovere eventuali detriti presenti all'interno dell'anello di taglio.Rimuovere il PBS con una pipetta di Pasteur e un aspiratore a vuoto. Ripetere il lavaggio con PBS fino a quando tutti i detriti non vengono rimossi. Per sterilizzare l'anello di taglio, si utilizzerà una combinazione di risciacquo con etanolo al 70% e irradiazione UV.Svitare il tappo forato, pipettare circa 10 millilitri di etanolo al 70% attraverso il portello di accesso e riavvitare il tappo. Ruotare e capovolgere più volte l'anello sigillante assicurandosi che l'interno dell'anello sia accuratamente lavato. Sotto una cappa a flusso laminare, aspirare l'eccesso di etanolo al 70%.Con un flacone spray, spruzzare accuratamente il portello di accesso e il coperchio con etanolo al 70%. Successivamente, posizionare l'anello di taglio e il coperchio sotto radiazione UV nella cappa a flusso laminare fino a completa asciugatura. Una volta asciutto l'anello di taglio, avvitare nuovamente il coperchio.Conservare gli anelli di taglio sterilizzati a temperatura ambiente fino al loro utilizzo nella coltura cellulare. Per preparare uno studio sulla tensione di taglio, piastrare innanzitutto le cellule endoteliali negli anelli di taglio sterilizzati seguendo il protocollo standard di coltura cellulare. Lasciare che la coltura raggiunga la confluenza prima di iniziare gli studi sul flusso.Quando le cellule hanno raggiunto la confluenza, posizionare gli anelli sperimentali per lo sforzo di taglio su un agitatore orbitale situato sul ripiano inferiore dell'incubatrice, per minimizzare lo stress e le vibrazioni del ripiano. Posizionare gli anelli per lo sforzo di taglio del gruppo di controllo statico all'interno della stessa incubatrice. Lasciare gli anelli per lo sforzo di taglio sull'agitatore per la durata desiderata di applicazione dello sforzo di taglio.Dopo che gli strati cellulari sono stati esposti al flusso di taglio per il tempo desiderato, rimuovere gli anelli di taglio dall'incubatrice. Togliere il coperchio dell'anello di taglio ed eseguire il recupero delle cellule e/o del mezzo per l'analisi finale desiderata. Si noti che, dopo l'apertura degli anelli di taglio, i ricercatori possono raccogliere cellule e mezzo per l'analisi mediante diverse metodiche.Di seguito sono mostrati risultati rappresentativi dell'aspetto di monocapistrati di cellule endoteliali cerebrali umane CMEC D3 nei dispositivi a flusso dopo 48 ore di esposizione a flusso laminare periodico o condizioni statiche; si osserva che l'allineamento del coltura non è sempre parallelo alla direzione del flusso indicata dalle frecce. Alcune risposte al flusso laminare periodico sono mostrate in monocapistrati di cellule endoteliali microvascolari retiniche di ratto. Dopo 72 ore di flusso laminare periodico nei dispositivi a flusso, si è osservata una riduzione significativa della molecola di adesione piastrina-cellula endoteliale rispetto al controllo di caricamento Beta-actina.Una volta acquisita padronanza, è possibile costruire diversi Shear Rings in circa tre ore, a condizione che la procedura venga eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di allineare con attenzione il disco interno con quello esterno, in modo che si formi tra loro un sigillo ermetico. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come costruire e utilizzare gli shear rings come metodo semplice per condurre studi *in vitro* di flusso periodico di fluidi e di stress di taglio su cellule endoteliali. Non dimenticare che lavorare con cloruro di metilene può essere pericoloso e che precauzioni, come lavorare sotto cappa chimica, devono essere sempre adottate durante i passaggi che lo richiedono.

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Stiamo descrivendo un metodo per soggetto cellule aderenti alle sollecitazioni di taglio a flusso laminare in un circuito sterile flusso continuo. L'adesione delle cellule ', morfologia possono essere studiati attraverso la camera trasparente, campioni ottenuti dal circuito per l'analisi metabolita e le cellule raccolte dopo l'esposizione di taglio per gli esperimenti futuri o della cultura.

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

Questo articolo descrive un metodo versatile per creare cellule derivate da anelli di tessuto cellulare self-assembly. Cellule muscolari lisce seminate in forma di anello aggregato agarosio pozzi e contratto a formare solide tridimensionali (3D) nei tessuti entro 7 giorni. Millimetrica scala anelli di tessuto sono favorevoli ai test meccanici e servono come mattoni per l'assemblaggio dei tessuti.

Diretto Cellular Self-Assembly di fabbricare Cell-Derived Anelli tessuto per l&#39;analisi biomeccanica e di ingegneria dei tessuti

Una piattaforma microcanali-on-a-chip è stato sviluppato dalla combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica. La piattaforma microcanali endothelialized imita il tridimensionale (3D) geometria in vivo microvasi, corre sotto flusso perfusione continua controllato, permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale e può essere applicato per la ricerca microvascolare.

Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte.

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Questo protocollo descrive un metodo di rivestimento per limitare la crescita delle cellule endoteliali a una regione specifica di una piastra a 6 po porsi per l'applicazione della sollecitazione di taglio utilizzando il modello di agitatore orbitale.

Segmentazione della crescita delle cellule endoteliali in piastre a 6 pozzi su uno shaker orbitale per studi meccanobiologici

Qui forniamo un chip microfluidico e un sistema microfluidico di circolazione automaticamente controllato e altamente efficiente che ricapitola il microambiente iniziale della neovascolarizzazione, consentendo alle cellule endoteliali (EC) di essere stimolate da elevate sollecitazioni di taglio luminali, livello fisiologico di flusso transendoteliale e distribuzione simultanea di vari fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF).

Modello microfluidico per imitare l&apos;evento iniziale di neovascolarizzazione

È necessario determinare quali lesioni aterosclerotiche progrediranno nella vascolarizzazione coronarica per guidare l'intervento prima che si verifichi l'infarto miocardico. Questo articolo delinea la modellazione biomeccanica delle arterie dalla tomografia a coerenza ottica utilizzando tecniche di interazione fluido-struttura in un risolutore commerciale agli elementi finiti per aiutare a prevedere questa progressione.

Tomografia a coerenza ottica basata sull'analisi dell'interazione fluido-struttura biomeccanica della progressione dell'aterosclerosi coronarica

Qui presentiamo un protocollo per fabbricare e operare un sistema microfluidico che espone le cellule endoteliali a iperglicemia oscillatoria sincronizzata e a stress di taglio pulsatile. Questo approccio fornisce un modello in vitro fisiologicamente rilevante per lo studio della disfunzione endoteliale diabetica. Questo protocollo consente la misurazione quantitativa dello stress ossidativo e delle risposte delle cellule endoteliali.

Un sistema microfluidico per modellare la disfunzione endoteliale sotto stress fisiologico di taglio pulsatile combinato e iperglicemia oscillatoria

Scopri come assemblare gli shear rings per studiare la fisiologia delle cellule endoteliali sotto stress da taglio fluido periodico. Questo metodo semplice ed economico permette di ottenere elevate repliche cellulari per valutare le risposte meccaniche in vitro.

LAssemblea e lapplicazione di Shear Anelli : A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio (Video) | JoVE Journal

L'Assemblea e l'applicazione di "Shear Anelli ': A Novel endoteliale modello per Orbital, unidirezionale e periodica del fluido di flusso e lo stress di taglio

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