Generazione di varianti di fuga di neutralizzare l'Influenza Virus anticorpi monoclonali

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un protocollo di lavoro su come chiarire l'epitopo di un anticorpo monoclonale neutralizzante. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'immunologia e della virologia che possono aiutare a definire le interazioni tra i virus dell'ospite, sviluppare terapie e strumenti diagnostici, tutti elementi che possono aiutare nella progettazione di vaccini. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita con tecniche di base di coltura tissutale e biologia molecolare senza strumenti o attrezzature speciali.

A dimostrare la procedura sarà Mark Bailey, un MD, dottorando del laboratorio di Peter Palese. Iniziare questa procedura con la caratterizzazione degli anticorpi in base all'inibizione dell'emoagglutinazione, o HI, e alle attività di neutralizzazione come descritto nel protocollo di testo. Gli anticorpi neutralizzanti che hanno attività HI vengono ulteriormente analizzati preparando prima quattro diluizioni dell'anticorpo di interesse in concentrazioni crescenti in una volta PBS in un volume di 100 microlitri per diluizione.

Successivamente, preparare una scorta virale di un milione di unità formanti placca per millilitro in una volta PBS in un volume di 400 microlitri. Quindi, mescolare 100 microlitri di un milione di unità formanti placche per millilitro di virus con 100 microlitri di ciascuna diluizione di anticorpi o 100 microlitri di una volta il PBS. Incubare i campioni per un'ora in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Dopo un breve vortice, iniettare 200 microlitri di ciascuna miscela in uova di gallina embrionate specifiche prive di agenti patogeni. Quindi, incubare le uova a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 40-44 ore. Dopo l'incubazione, sacrificare gli ovuli embrionali infetti dal virus ponendoli a quattro gradi Celsius per un minimo di sei ore.

Successivamente, raccogli il liquido allantoideo dalle uova come descritto in precedenza. Infine, confermare le varianti di fuga eseguendo il test HI come descritto nel protocollo di testo. Per generare varianti di fuga contro gli anticorpi neutralizzanti che mancano di attività HI, il virus deve essere fatto passare in presenza di quantità crescenti di anticorpi.

Piastra delle cellule MDCK in una piastra a sei pozzetti a una densità di un milione di cellule per pozzetto. Incubare le cellule per un minimo di quattro ore in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Nel frattempo, diluire lo stock virale a un milione di unità di formazione della placca per millilitro.

Preparare una singola diluizione di anticorpo a 0,02 milligrammi per millilitro in una volta MEM con tripsina trattata con TPCK in un volume di 250 microlitri. Utilizzare concentrazioni di anticorpi più elevate per tutti i passaggi successivi. Mescolare 250 microlitri di virus diluito con 250 microlitri di anticorpi diluiti, o 250 microlitri di una volta il MEM come controllo senza anticorpi.

Incubare la miscela di anticorpi virali per 30 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione delle cellule, aspirare il terreno utilizzando una pipetta di vetro Pasteur e lavare il monostrato di cellule con un millilitro di PBS una volta. Aggiungere 500 microlitri di miscele nei pozzetti prima di incubare in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un'ora.

Dopo un'ora, integrare i pozzetti con due millilitri di una volta MEM con tripsina trattata con TPCK. Controllare le cellule al microscopio 48 ore dopo l'infezione per rilevare la presenza di segni dell'effetto citopatico, o CPE, o eseguire un test di emoagglutinazione per rilevare una crescita virale. Se c'è CPE di crescita nella coltura integrata con anticorpi, raccogliere il surnatante in più criotubi.

Etichettare i tubi con il numero di passaggio e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Conservare 100 microlitri di surnatante per infettare un nuovo monostrato di MDCK con due millilitri di una volta MEM integrato con tripsina TPCK e anticorpi. Ricordati di includere un controllo senza anticorpi per ogni passaggio.

Aumentare la concentrazione dell'anticorpo in ogni passaggio successivo fino a quando la crescita del virus è ancora vitale, anche con la concentrazione finale di 0,6 milligrammi per millilitro di anticorpo. Congelare le fiale multiple di surnatante di ogni passaggio e conservare a meno 80 gradi Celsius. Continuare con l'isolamento e l'analisi delle varianti sfuggite come dettagliato nel protocollo di testo.

Gli anticorpi indotti dal vaccino isolati da individui vaccinati con il candidato vaccino contro l'influenza H7N9 A sono stati utilizzati per generare varianti mutanti di fuga. La mappatura dei mutanti di fuga ha rivelato che molti degli anticorpi riconoscevano residui critici in posizioni distinte sull'HA virale. Ogni residuo, indicato in rosso, rappresenta la posizione degli amminoacidi critici necessari per un legame efficiente di un anticorpo monoclonale, mentre la maggior parte degli anticorpi HI-positivi è sfuggita a residui mutanti vicino a siti antigenici precedentemente riportati dell'H7HA. Gli anticorpi HI-negativi hanno generato mutanti di fuga con mutazioni puntiformi nella regione di riserva.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere applicata per chiarire i determinanti strutturali della protezione contro altri agenti patogeni. Questa tecnica non si limita solo alla generazione di varianti di fuga di anticorpi monoclonali, ma anche contro i composti antivirali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come chiarire l'epitopo di legame degli anticorpi monoclonali generando varianti di fuga in vitro.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere cauti quando si lavora con i virus e di utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati.