Generazione di varianti di fuga di neutralizzare l'Influenza Virus anticorpi monoclonali

L'obiettivo generale di questo metodo è fornire un protocollo operativo su come chiarire l'epitopo di un anticorpo monoclonale neutralizzante. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'immunologia e della virologia, utili per definire le interazioni ospite-virus, sviluppare terapie e strumenti diagnostici, tutti elementi che possono supportare la progettazione di vaccini. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita utilizzando tecniche di base di coltura cellulare e biologia molecolare, senza la necessità di strumenti o attrezzature speciali.

Il procedimento sarà dimostrato da Mark Bailey, studente di medicina e dottorato di ricerca del laboratorio di Peter Palese. Iniziare questo procedimento con la caratterizzazione degli anticorpi basata sull'inibizione dell'emagglutinazione, o HI, e sulle attività di neutralizzazione come descritto nel protocollo testuale. Gli anticorpi neutralizzanti che presentano attività HI vengono ulteriormente analizzati preparando innanzitutto quattro diluizioni dell'anticorpo di interesse in concentrazioni crescenti in PBS una volta, in un volume di 100 microlitri per ogni diluizione.

Successivamente, preparare una soluzione virale di un milione di unità formanti placche per millilitro in un volume di 400 microlitri di PBS 1x. Quindi, mescolare 100 microlitri di un milione di unità formanti placche per millilitro di virus con 100 microlitri di ciascuna diluizione di anticorpo oppure con 100 microlitri di PBS 1x. Incubare i campioni per un'ora in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Dopo aver agitato brevemente, iniettare 200 microlitri di ciascuna miscela in uova di pollo embrionate libere da agenti patogeni specifici. Successivamente, incubare le uova a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 40-44 ore. Al termine dell'incubazione, sacrificare le uova embrionate infette ponendole a quattro gradi Celsius per un minimo di sei ore.

Successivamente, raccogliere il liquido allantocoico dalle uova come descritto in precedenza. Infine, confermare le varianti di fuga eseguendo il saggio di inibizione dell'emagglutinazione (HI) come descritto nel protocollo testuale. Per generare varianti di fuga contro anticorpi neutralizzanti che non presentano attività HI, il virus deve essere passaggiato in presenza di quantità crescenti di anticorpo.

Piastrella le cellule MDCK in una piastra a sei pozzetti a una densità di un milione di cellule per pozzetto. Incubare le cellule per un minimo di quattro ore in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Nel frattempo, diluire il ceppo virale a un milione di unità formanti placche per millilitro.

Preparare una singola diluizione di anticorpo a 0,02 milligrammi per millilitro in MEM 1x con tripsina trattata con TPCK in un volume di 250 microlitri. Utilizzare concentrazioni maggiori di anticorpo per tutti i passaggi successivi. Mescolare 250 microlitri di virus diluito con 250 microlitri di anticorpo diluito oppure con 250 microlitri di MEM 1x come controllo senza anticorpo.

Incubare la miscela di virus e anticorpo per 30 minuti in un incubatore a 37 °C con 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione delle cellule, aspirare il mezzo utilizzando una pipetta di Pasteur in vetro e lavare il monostrato cellulare con un millilitro di PBS 1x. Aggiungere 500 microlitri delle miscele nei pozzetti prima di incubare in un incubatore a 37 °C con 5% di anidride carbonica per un'ora.

Dopo un'ora, integrare le pozzette con due millilitri di MEM una volta con tripsina trattata con TPCK. Controllare le cellule a 48 ore post-infezione per osservare segni dell'effetto citopatico, o CPE, al microscopio, oppure eseguire un saggio di emoagglutinazione per rilevare la crescita virale. Se si osserva crescita con CPE nella coltura integrata con anticorpo, raccogliere il sopranatante in più crioprovette.

Etichettare i tubi con il numero di passaggio e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Conservare 100 microlitri del sopranatante per infettare un nuovo monostrato di MDCK con due millilitri di MEM uno per integrato con tripsina TPCK e anticorpo. Ricordare di includere un controllo senza anticorpo per ogni passaggio.

Aumentare la concentrazione dell'anticorpo in ogni passaggio successivo fino a quando la crescita del virus rimane vitale, anche con la concentrazione finale di 0,6 milligrammi per millilitro di anticorpo. Congelare le diverse provette di supernatante di ciascun passaggio e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Procedere all'isolamento e all'analisi delle varianti scappate come descritto nel protocollo testuale.

Gli anticorpi indotti dal vaccino, isolati da individui vaccinati con il vaccino sperimentale contro l'influenza A H7N9, sono stati utilizzati per generare varianti virali con capacità di fuga. L'analisi del mapping dei mutanti di fuga ha rivelato che molti di questi anticorpi riconoscono residui critici in posizioni distinte dell'emagglutinina virale (HA). Ogni residuo, indicato in rosso, rappresenta la posizione di aminoacidi essenziali necessari per un efficiente legame con un anticorpo monoclonale, mentre la maggior parte degli anticorpi positivi al test di inibizione dell'emagglutinazione (HI) presenta mutanti in residui localizzati nelle vicinanze dei siti antigenici dell'H7HA precedentemente descritti. Gli anticorpi negativi al test HI hanno generato mutanti di fuga con mutazioni puntiformi nel dominio di ancoraggio.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere applicata per chiarire i determinanti strutturali della protezione contro altri patogeni. Questa tecnica non è limitata solo alla generazione di varianti di fuga di anticorpi monoclonali, ma anche contro composti antivirali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come chiarire l'epitopo di legame degli anticorpi monoclonali generando varianti di fuga in vitro.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di essere cauti quando si lavora con virus e di utilizzare un'adeguata attrezzatura di protezione personale.