Adattamento della tecnologia Array microelettrodo per lo studio di neurotossicità indotta da anestesia nel cervello intatto Piglet

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di utilizzare una nuova applicazione della tecnologia di array di microelettrodi basata su enzimi per misurare i neurotrasmettitori nei suinetti neonatali. In questo esempio, l'attività del glutammato in vivo viene esaminata per studiare la neurotossicità indotta dall'anestesia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può misurare l'attività dei neurotrasmettitori in vivo con un'eccezionale risoluzione spaziale e temporale in un modello animale clinicamente rilevante di neurotossicità indotta dall'anestesia.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui meccanismi della neurotossicità indotta dall'anestesia, può essere applicato anche ad altri stati patologici, come traumi cerebrali pediatrici, epilessia e ictus. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché l'uso del modello di suinetto richiede esperienza e pratica nell'implementazione. Inoltre, l'uso di array di microelettrodi richiede un set di competenze specializzate.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi chirurgiche e di posizionamento dei microelettrodi sono difficili da imparare, a causa della loro natura delicata. Per questo esperimento, utilizzare i suinetti durante il loro periodo di massima crescita cerebrale, quando hanno dai tre ai cinque giorni. Lasciali acclimatare per almeno 24 ore prima dell'esperimento.

Il personale addestrato deve prendersi cura dei suinetti. Dovrebbe essere fornito loro l'accesso ad lib a nutrimento, coperte e alcuni giocattoli per gli stimoli. Almeno tre ore prima dell'anestesia, rimuovere il sostituto del latte dalla gabbia per assicurarsi che lo stomaco del suinetto sia vuoto.

Segui le linee guida ARRIVE per eliminare qualsiasi potenziale fattore confondente basato sul sesso. Successivamente, presso una postazione di anestesia dotata di ventilatore pediatrico e di opportuni dispositivi di monitoraggio, intubare e ventilare meccanicamente il suinetto. Quindi, somministrare l'anestesia con sevoflurano a 1 MAC per 3,5 ore di anestesia.

Ora, usa un pizzico per confermare un'adeguata profondità di anestesia, quindi fissa il suinetto a un telaio stereotassico specifico per suinetto che abbia un'imbottitura adeguata. Posizionare i denti della mascella sopra la barra dei denti. Quindi, fissare e stringere le due barre auricolari penetranti con il maialino centrato sulla linea mediana.

Inserire le barre auricolari abbastanza saldamente da sentire le membrane timpaniche scoppiare. Iniziare una dose di carico di rocuronio e un'infusione per evitare movimenti mentre il suinetto è fissato nel telaio. È fondamentale che il suinetto rimanga al caldo e che i suoi segni vitali siano monitorati.

Utilizzare una lampada riscaldante e/o una coperta per mantenere la normale termia. Assicurati che la lampada termica non sia così vicina da bruciare. Se si desidera la sopravvivenza dei suinetti, assumere ulteriori preparazioni per mantenere sterile il campo chirurgico.

A questo punto, procedere con l'impianto dell'array di microelettrodi. Per iniziare, crea un'incisione della linea mediana da quattro a sei centimetri lungo il cranio, facendo attenzione per evitare di segnare il cranio con il bisturi. Una volta praticata l'incisione, utilizzare una retrazione delicata e una dissezione smussata per sollevare il cuoio capelluto dal cranio.

Successivamente, strofina delicatamente il cranio con una garza per rimuovere il tessuto connettivo ed esporre le linee di sutura. Quindi determinare la posizione prevista per la craniotomia. Se l'area di interesse rimane oscurata, riflettere ulteriormente il cuoio capelluto.

Ora, usa un trapano chirurgico per creare una finestra per craniotomia di circa 0,25 centimetri quadrati che sovrasta la struttura di interesse. Fare attenzione a non danneggiare la dura madre o il cervello sottostante. Se necessario, utilizzare strumenti chirurgici fini per asportare la dura madre sovrastante il tessuto cerebrale.

Usare estrema attenzione per evitare di danneggiare il cervello. Questo esperimento utilizza un array di microelettrodi basato su enzimi precedentemente descritto pre-rivestito con glutammato ossidasi ed elettrolitico con mPD. Gli array di microelettrodi hanno uno stelo rigido da 40 millimetri, personalizzato per l'uso con i suinetti.

Fissare il braccio metallico al micromanipolatore, quindi posizionare l'array di microelettrodi il più verticalmente possibile sopra il bregma. Quindi, abbassare con cautela l'array il più in basso possibile senza toccare la superficie del cranio, annotando le coordinate del bregma. Ora usa un atlante cerebrale di maialino per determinare le esatte coordinate stereotassiche della struttura di interesse, quindi riposiziona il microelettrodo di conseguenza.

Successivamente, posizionare l'elettrodo di pseudo-riferimento sotto il cuoio capelluto, assicurando il contatto con l'animale. Ora abbassa lentamente l'array di microelettrodi nel cervello fino quasi alla profondità appropriata. Per gli ultimi due millimetri di corsa, utilizzare un microazionamento idraulico per abbassare delicatamente l'array nella struttura di interesse con un trauma tissutale minimo.

Dopo aver posizionato l'array di microelettrodi, attendere 30 minuti per consentire agli elettrodi di raggiungere la linea di base. Quindi, prendi le misure per circa tre ore. Se il suinetto deve sopravvivere all'esperimento, chiudere l'incisione dopo aver raccolto i dati.

Le misurazioni in vivo del glutammato in tempo reale sono state effettuate nell'ippocampo di suinetti di tre o quattro giorni in anestesia con sevoflurano, come descritto. Le sessioni di registrazione hanno superato le tre ore. Le misure amperometriche sono state registrate a 4 hertz e convertite in concentrazione utilizzando una regressione lineare basata sui parametri di calibrazione.

Per ogni punto temporale, i segnali provenienti dai due siti sensibili al glutammato sono stati mediati prima di sottrarre il segnale sentinella media, per produrre un segnale corretto del glutammato. La concentrazione media di glutammato basale era di circa 4,6 micromoli ed è rimasta relativamente stabile nel corso dell'esposizione all'anestetico. L'attività glutammatergica transitoria è stata identificata analizzando i picchi nel segnale che non erano correlati con il segnale sentinella e avevano un rapporto segnale/rumore maggiore di tre.

Un totale di 116 picchi transitori sono stati rilevati durante il periodo sperimentale. L'ampiezza dei picchi transitori risultanti è stata generalmente osservata entro l'intervallo di 1 micromole. Al fine di quantificare la durata di ciascun transitorio, è stato ottenuto il tempo necessario per ogni valore massimo di picco per decadere dell'80%, ed è risultato essere di circa 4-5,5 secondi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore, se eseguita metodicamente e con attenzione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo qualsiasi danno tissutale non intenzionale che possa confondere i dati sperimentali. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la misurazione di altri analiti elettrochimici, per rispondere a ulteriori domande.