Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Questo flusso di lavoro proteomica consente l'identificazione imparziale e la mappatura delle interazioni proteina-proteina endogena con risoluzione subcellulare. Questa tecnica è particolarmente vantaggiosa quando si studiano proteine esca che sono sensibili al dosaggio, bassa abbondanza o hanno più localizzazioni subcellulari. Questo metodo potrebbe essere applicato alla mappatura delle interazioni proteiche endogene supponendo che sia disponibile un reagente di affinità adatto.

Ciò è particolarmente importante per molte delle migliaia di proteine che hanno una funzione sconosciuta, molte delle quali sono state collegate alle malattie umane. Questo metodo può essere adattato a qualsiasi linea cellulare o tessuto suscettibile al frazionamento subcellulare. Qualsiasi proteina con un reagente di affinità adatto potrebbe essere presa di mira.

Un risultato comune per gli esperimenti di purificazione dell'affinità spesso non è un risultato. Reagenti davvero buoni, raccolta di dati qc in tutto e limitazione della gestione dei campioni sono tutti davvero importanti. Sa' che hai un campione.

Per iniziare, scongelare i pellet cellulari preparati per 15 minuti in 1X volume di pellet di tampone freddo A con inibitori della proteasi o inibitori della fosfatasi. Posizionare il tubo contenente il pellet cellulare su un nutatore a quattro gradi Celsius per aiutare in resuspensione per 30 minuti. Quindi posizionare il tubo in una centrifuga a 2.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti a pellet.

Decantare il supernatante e rimescolare le cellule con 5 volte il volume della cella imballata con tampone A.Incubate sul ghiaccio per 20 minuti. Quindi, pellet di nuovo a 2.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Decantare il tampone e resuspend con tampone di volume cellulare confezionato originale 2X A con inibitori della proteasi o inibitori della fosfatasi.

Dounce circa sette volte con il pestello sciolto A.Centrifuga il lignaggio per 10 minuti a 2.000 volte g e quattro gradi Celsius. Trasferire con cura il supernatante su un nuovo tubo e congelarlo con azoto liquido. Conservare il lysate a meno 80 gradi Celsius.

Rimescolare il pellet con un volume di pellet 0,9X di tampone B con inibitori della proteasi o inibitori della fosfatasi e mescolare su un nutatore per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Per lire i nuclei, dounce 20 volte con il pestello del titolo B.Mescolare il lysate nucleare su un nutator per 30 minuti a quattro gradi Celsius in modo che sia omogeneo. Quindi centrifugare il lisato nucleare per 30 minuti a 21.000 volte g a quattro gradi Celsius.

Pipettare fuori dal supernatante e risparmiare come estratto proteico nucleare solubile. Per dializzare l'estratto nucleare solubile, tagliare prima una lunghezza appropriata di 24 tubi di dialisi di larghezza millimetri con un taglio del peso molecolare di otto kilodalton. Bloccare un lato del tubo e caricare il nucleoplasma nel tubo.

Dopo aver caricato il lisato, bloccare l'altra estremità e immergersi in un contenitore di vetro pulito contenente tampone C con inibitori della proteasi. Dializzare per tre ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, trasferire il nucleoplasma dell'estratto nucleare dializzato in un tubo e centrifugare a 21.000 volte g a quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Trasferire tre aliquote di 20 microliter dell'estratto nucleare in nuovi tubi a microcentrifugo per la convalida del frazionamento mediante macchia occidentale. Utilizzando punte di pipetta tagliate sulla punta, preparare una miscela proteica di perline A/G per ogni replica combinando il volume di perline da 12,5 microlitri della proteina A Sefarose con 12,5 microlitri di proteina G Sepharose in tubi di microcentrifugo. Lavare la miscela di perline A/G proteica due volte con 300 microlitri di tampone IP I.Ruotare le perline a 1.500 volte g a quattro gradi Celsius per un minuto e decantare il tampone.

Quindi, preparare le perline A/G della proteina anticorpale. Per legare l'anticorpo alle perline, aggiungere al tubo 300 microlitri del tampone IP I e 10 microgrammi dell'anticorpo desiderato. Lasciare che la miscela di anticorpi perline ruoti su un nutator a quattro gradi Celsius durante la notte.

Ora i volumi appropriati dei lysati nucleari si trasformano in tubi a microcentrifugo a bassa ritenzione per un milligrammo di input proteico per replicazione. Ruotare il lysate a 16.000 volte g per 30 minuti e trasferire il supernatante su un nuovo tubo. Aggiungere un microlitro di Benzonasi a 250 unità per microlitro per ogni milligrammo del lysato nucleare e rocciare su un nutatore a quattro gradi Celsius per 10-15 minuti.

Per preparare le perline per la pre-cancellazione del lysate, aggiungere 12,5 microlitri di ciascuna proteina A e perline proteiche G a tubi a bassa ritenzione da 1,5 millilitri. Lavare due volte con tampone di lavaggio IP I con inibitori della proteasi. Decantare il tampone e aggiungere un milligrammo del lysate nucleare preparato alle perline.

Incubare mentre si dondola su un nutator per un'ora a quattro gradi Celsius. Centrifuga i lire pre-sgomberati a 1,500 volte g e quattro gradi Celsius per un minuto. Quindi lavare la proteina anticorpale A o G perline due volte con tampone IP I con inibitori della proteasi.

Dopo aver centrifugato a 1.500 volte g e quattro gradi Celsius per un minuto, decantare il buffer. Ora trasferisci il lysato nucleare pre-cancellato sulla proteina anticorpale A o G perline. Incubare mentre si dondola su un nutator a quattro gradi Celsius per quattro ore.

Dopo l'incubazione, centrifugare a 1.500 volte g e quattro gradi Celsius per un minuto. Trasferire il supernatante in tubi etichettati come flusso attraverso per ogni replica. Lavare la proteina anticorpale A o G perline quattro volte con un millilitro di tampone IP II con inibitori della proteasi.

Quindi lavare le perline due volte con un millilitro di buffer IP I con inibitori della proteasi. Assicurarsi che tutto il buffer venga rimosso dopo l'ultimo lavaggio. Elute proteina dalle perline incubando con 20 microlitri di 0,1 glicina molare a pH 2,75 ciascuno per 30 minuti su un nutator.

Quindi girare a 750 volte g e quattro gradi Celsius per un minuto e pipettare fuori dal supernatante. Ripetere questa incubazione con tampone di eluizione una seconda volta. Dopo aver preparato il pellet proteico, rimotivarlo con 30 microlitri di tampone di alchilazione SDS.

Incubare il campione su un blocco termico di 95 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere 300 millilitri di soluzione di UA e 30 microlitri di TCEP da 100 millimolare ad ogni campione.

Caricare la soluzione su un filtro centrifugo 30K. Dopo aver ruotato il filtro centrifugo a 21.000 volte g a temperatura ambiente per 10 minuti, mantenere il flusso attraverso nel caso in cui si sia un problema con il filtro. Dopo aver lavato il filtro secondo il manoscritto, aggiungere tre microlitri di un microgrammo per microlitro lyse C rimescolato in tris pH 8.5 molare 0,1.

Riempire i filtri fino al segno di 100 microliter con 0,1 tris molare pH 8.5. Lasciare digerire per un'ora a 37 gradi Celsius mentre dondola su un nutator. Aggiungere quindi un microlitro di un microgrammo per microliter ms grade trypsin.

Mescolare delicatamente e lasciare che la tripside incubare con il campione durante la notte a 37 gradi Celsius mentre dondola su un nutator. Al mattino, centrifugare più volte a 21.000 volte g per 20 minuti per elutare i peptidi dal filtro in un tubo di microcentrifugo pulito a bassa ritenzione. Dopo aver dissaleto i peptidi usando colonne di spin C18, riprendono i peptidi liofilizzati in sette microlitridi dello 0,1%TFA nel 5%acetonitrile.

Sonicare il campione per tre minuti per assicurarsi che i peptidi siano stati rimorsi, quindi girare verso il basso a 14.000 volte g per 10 minuti. Caricare dal 15 al 30% del campione sul sistema di spettrometria di massa della cromatografia liquida per l'analisi. In questo studio, le immunoprecipitazioni triplicate sono state analizzate da cinque milligrammi di estratto nucleare HeLa utilizzando un controllo solo perline.

L'esca DYRK1A si è classificata tra le prime tre proteine arricchite sul controllo che indica che l'esperimento IP-MS eseguito era affidabile. Una netta separazione è stata mostrata tra gli interattori ad alta confidenza e più del 95% delle proteine copurificate sono state identificate come non specifiche. Per l'esempio del set di dati DYRK1A, i partner interazione IREF hanno presentato valori FC-A fino a 0,45 che rappresentano un arricchimento molto basso rispetto al controllo.

Di conseguenza, molte di queste interazioni precedentemente riportate sono falsi negativi all'interno di questo set di dati scendendo al di sotto della soglia FC-A di tre. Il numero di copia assoluto calcolato di ogni interazione IREF non ha mostrato alcuna correlazione con i livelli di rilevamento di un partner interazione da parte di IP-MS. L'uso combinato di FC-A maggiore di tre e santo maggiore di 0,9 ridusse la lista degli interattori ad alta confidenza a sei proteine.

Tuttavia, quando si applica un taglio FC-A maggiore di tre in isolamento, sono state aggiunte otto proteine aggiuntive alla rete. La parte più cruciale di questo protocollo è la selezione del reagente anticorpale per l'immunoprecipitazione. La convalida western blot o Coomassie della selettività è consigliata prima di completare questo flusso di lavoro.

Prove a sostegno delle interazioni proteina-proteina possono essere avuto dal co-IP western blotting di interattori identificati. Il cross-linking chimico proteico, sebbene più complesso, può rivelare domini di interazione di interattori. Con questo metodo, il mio gruppo di ricerca ha scoperto nuove funzioni per la DYRK1A, una protein chinasi necessaria per lo sviluppo cerebrale dei mammiferi e collegata alla neuropatologia del morbo di Alzheimer.