Monitoraggio delle dinamiche di interazione proteina-RNA in vivo ad alta risoluzione temporale utilizzando χCRAC

Il CRAC cinetico può essere utilizzato per studiare le associazioni temporali tra l'RNA e le proteine leganti l'RNA su una scala temporale breve senza precedenti. Se combinato con il nostro reticolante, il CRAC cinetico è in grado di reticolare cellule vive in pochi secondi. Ciò riduce le risposte ai danni UV e facilita lo studio delle risposte allo stress con una risoluzione su scala minima.

Kinetic CRAC è un protocollo molto lungo che può essere impegnativo per i nuovi utenti. Inoltre, lavorare con l'RNA pone le sue sfide. Per prevenire la degradazione dell'RNA, è necessario filtrare, sterilizzare tutte le soluzioni e assicurarsi che le pipette e il banco da laboratorio siano mantenuti puliti.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché alcuni passaggi non sono molto intuitivi. Ciò include la reticolazione UV e la raccolta di cellule, nonché l'estrazione di RNA reticolati dal gel. Per eseguire la reticolazione UV su microrganismi in soluzione, inoculare 3,5 litri del terreno desiderato con lievito fino a un OD iniziale di 600 di 0,05 e far crescere la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione continua a 180 giri/min.

Una volta che le cellule raggiungono l'OD desiderato, versare 500 millilitri di coltura direttamente nel reticolante Vari-X-linker e irradiarlo con 250 millijoule di UV a 254 nanometri. Dopo la reticolazione, utilizzare un dispositivo di filtrazione sottovuoto per filtrare le celle. Arrotolare la membrana con le cellule filtrate e metterla in una provetta conica da 50 millilitri etichettata T0. Filtrare le cellule rimanenti su sei diversi filtri e far cadere le membrane in tre litri di terreno preriscaldato che induce lo stress, mescolandole energicamente con una pipetta per 50 secondi. Continuare a reticolare le cellule in volumi di 500 millilitri nei punti temporali desiderati e conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius.

Per reticolare le cellule aderenti, trasferire la piastra di coltura al quarzo con le cellule nel vassoio specializzato e irradiarla con 300 millijoule di UV a 254 nanometri. Mettere immediatamente il piatto sul ghiaccio. Rimuovi il terreno di coltura dal piatto e aggiungi 10 millilitri di PBS ghiacciato. Raccogli le cellule raschiandole e trasferiscile in una provetta conica da 15 millilitri.

Quindi pellettare le celle mediante centrifugazione a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato le celle con PBS, rimuovere il PBS e congelare a scatto il pellet della cella su ghiaccio secco. Conservare il campione a meno 80 gradi Celsius, se necessario.

Impostare la centrifuga a quattro gradi Celsius e preparare due file di provette da 1,5 millilitri per campione per l'eluizione. Ruota rapidamente le colonne con le perline di nichel per eliminare il volume vuoto. Quindi posizionare le colonne nella prima fila di provette di eluizione e riempirle con 200 microlitri di tampone di eluizione.

Dopo due minuti, far girare rapidamente le colonne e trasferirle nella seconda fila di tubi. Quindi ripetere l'eluizione come precedentemente dimostrato. Al termine, unire tutti gli eluati in un tubo da cinque millilitri e aggiungere due microlitri di glicogeno da 20 milligrammi per millilitro.

Quindi aggiungere 100 microlitri di acido tricloroacetico al campione e agitarlo per 30 secondi. Dopo aver lavato il campione con acetone, risospenderlo in 30 microlitri di tampone di carica proteica. Quindi, controllare la radioattività utilizzando il contatore Geiger.

Riscaldare il campione per 10 minuti a 65 gradi Celsius e caricarlo su un gel Bis-Tris prefabbricato da un millimetro al 12%. Far funzionare il gel per 90 minuti a 125 volt nel tampone MOPS. Al termine, avvolgere il gel nella pellicola trasparente e fissarlo all'interno di una cassetta a tenuta di luce con del nastro adesivo.

Dopo aver esposto il gel alla pellicola autoradiografica, sviluppare la pellicola tagliando via la pellicola trasparente che copre il gel, assicurandosi di non spostare il gel e sfalsare l'immagine. Posizionare la pellicola sopra il gel e asportare la fascia di interesse. Metti la fetta di gel in una provetta da due millilitri e schiacciala con un puntale per pipetta P1000.

Quindi aggiungere il tampone proteinasi K e la proteinasi K.Incubare il campione a 55 gradi Celsius agitando vigorosamente. Far funzionare il cDNA su un gel prefabbricato al 6% di TBE a 100 volt per un'ora, utilizzando una scala appropriata per la quantificazione di frammenti di DNA corti. Al termine, posizionare il gel in un contenitore a tenuta stagna con una quantità sufficiente di TBE per coprirlo e aggiungere una quantità adeguata di colorante SYBR Safe.

Macchiare il gel per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi sostituire il tampone contenente SYBR con TBE fresco. Lavare il gel per 10 minuti agitando delicatamente.

Scolare il TBE e mettere il gel in una cartella trasparente. Taglia la cartella a una dimensione appropriata e immagina il gel con un'immagine quantitativa. Estrarre i frammenti di DNA tra 175 e 400 paia di basi e mettere il pezzo di gel in una provetta da 1,5 millilitri.

Schiacciare il gel con un puntale per pipetta P1000 e aggiungere 400 microlitri di acqua. Quindi incubarlo per un'ora a 37 gradi Celsius agitandolo. Congelare il campione su ghiaccio secco per 10 minuti.

Quindi ripetere l'incubazione a 37 gradi Celsius. Inserire due filtri in microfibra di vetro all'interno di una colonna filtrante posta in un tubo. Quindi, utilizzare un puntale per pipetta P1000 tagliato per trasferire la sospensione di gel TBE nell'unità filtrante e centrifugarla a 17.000 G per 30 secondi.

Questo protocollo è stato utilizzato per monitorare le interazioni Nrd1-RNA in cellule di lievito sottoposte a un ambiente affamato di glucosio. I campioni sono stati reticolati prima del passaggio al terreno senza glucosio, così come uno, due, quattro, otto, 14 e 20 minuti dopo. Le autoradiografie dell'esperimento hanno mostrato un segnale intenso al peso molecolare atteso di Nrd1, che rappresenta la proteina legata a brevi RNA radiomarcati non suscettibili di sequenziamento.

Il segnale al di sopra di questa banda, che è la proteina reticolata a frammenti di RNA più lunghi, è stato isolato. Per modificare il protocollo CRAC cinetico per le cellule di mammifero, è stato sviluppato uno stadio speciale per consentire l'irradiazione UV di piastre con cellule aderenti. L'efficienza di questa configurazione è stata misurata attraverso la reticolazione e l'acquisizione di GFP RBM7 con tag stabili.

Il reticolante è stato in grado di recuperare complessi proteici di RNA da cellule di mammifero utilizzando l'irradiazione UV a 254 nanometri con efficienze paragonabili a un dispositivo di irradiazione UV ampiamente utilizzato. Lo sviluppo di una piastra di Petri di quarzo permeabile ai raggi UV durante la reticolazione ha ulteriormente migliorato il recupero dei complessi proteici di RNA. I dati di Nrd1 mostrano che la proteina si lega a molti trascritti di RNA non codificanti, indicando che è coinvolta nella degradazione di questi trascritti.

È stato anche dimostrato il legame con i trascritti che codificano per HXT6 e HXT7, entrambi sovraregolati durante la carenza di glucosio. Il CRAC cinetico consente di misurare le interazioni dinamiche tra gli RNA proteici durante lo sviluppo cellulare, le risposte allo stress e l'assemblaggio di complessi macromolecolari, come il ribosoma o lo spliceosoma.