Visualizzazione bidimensionale e quantificazione di labile, nutrienti vegetali inorganici e contaminanti nel suolo

Il ciclo bio-chimico degli elementi nel suolo svolge un ruolo cruciale nei sistemi ambientali. Con questo protocollo, la distribuzione delle frazioni di elementi disponibili per le piante può essere visualizzata in 2D utilizzando l'imaging con spettrometria di massa DGT. Questo metodo è unico nella sua capacità di visualizzare e quantificare i livelli di tracce di più specie di soluti inorganici all'interfaccia del soluto, superando sostanzialmente la risoluzione spaziale dei metodi alternativi.

Oltre allo studio dei flussi di lavoro e soluti nei suoli e nei sedimenti, questo metodo può essere applicato per studiare come le radici delle piante assorbono gli elementi nutritivi e contaminanti. Per la fabbricazione di gel DGT, rivestire prima un film sottile di sospensione di gel legante cationico misto a base di poliuretano su una lastra di vetro e posizionare la piastra in un forno per avviare la formazione del gel mediante evaporazione del solvente. Dopo aver ripetuto l'applicazione e l'evaporazione tre volte, idratare la lastra di vetro a triplo rivestimento risultante in un bagno d'acqua per ottenere un gel legante anionici e cationi misto sottile 0,1 millimetri, antistrappo.

Per assemblare il rizotrone, utilizzare due morsetti per fissare una piccola lama acrilica nella parte inferiore dell'aumento del rizotrone con la pressione dei morsetti diretti sul telaio del rizotrone, in modo che la piastra non si pieghi verso l'interno. Inclinare leggermente il rizotrone verso la piccola piastra di plastica e riempire il rizotrone con terriccio pre-inumidito fino a un'altezza approssimativa di quattro centimetri. Agitare leggermente il rizotrone per distribuire uniformemente il terreno e utilizzare uno strumento di compattazione per comprimere delicatamente il terreno di alcuni millimetri.

Ripetere il riempimento e la compressione fino a quando il rizotrone non si riempie di terra, lasciando uno spazio di tre centimetri nella parte superiore. Utilizzare del nastro adesivo per fissare con cura un pezzo di foglio di PTFE di 13 x 22 centimetri al telaio del rizotrone un angolo alla volta, applicando tensione per garantire una superficie piana della lamina. Quando la lamina di PTFE è piatta e contigua alla superficie del suolo, attaccare un secondo pezzo di lamina sull'estremità inferiore del rizotrone, sovrapponendo il pezzo superiore di lamina di PTFE di un centimetro allo stesso modo.

Quando il secondo pezzo è stato fissato, applicare una copertura protettiva in pellicola di plastica. Posiziona una piastra frontale sul rizotrone riempito di terra e coperto di alluminio e posiziona un binario attorno a ciascun lato del rizotrone. Quindi serrare le viti a mano per fissare le guide della piastra frontale al rizotrone con le viti posizionate verso il lato chiuso del rizotrone.

Per innaffiare il terreno, spingere le punte delle pipette nei fori di irrigazione e lasciare che l'acqua scorra nel terreno per gravità. Per coltivare le piante, pianta fino a due piantine nel rizotrone e aggiungi cinque millilitri di acqua direttamente alle piantine per sostenerne la crescita. Copri l'apertura superiore del rizotrone per i primi due giorni dopo la semina con una pellicola trasparente che trattiene l'umidità e avvolgi il rizotrone in un foglio di alluminio per prevenire la crescita microfitica.

Quindi posizionare il rizotrone piantato in una stanza di crescita con le condizioni ambientali impostate in base alle specifiche esigenze della pianta e inclinare il rizotrone da 25 a 35 gradi per garantire lo sviluppo delle radici lungo la piastra frontale tramite gravitropismo. Per applicare il gel DGT fabbricato, tagliare una membrana in policarbonato spessa 10 micron con una dimensione dei pori di 0,2 micron a una larghezza e lunghezza di almeno un centimetro di ciascun lato del gel e posizionare la membrana sul gel. Applicare acqua per rimuovere le bolle d'aria dalla pila e utilizzare del nastro isolante in vinile per fissare la membrana alla piastra lungo tutti e quattro i bordi del gel.

Dopo aver rimosso la piastra frontale e le pellicole protettive, allineare il mirino di una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo dotata di obiettivo macro al centro della regione di interesse nel gel e includendo una barra della scala nell'immagine acquisire una foto ortogonale della regione di interesse. Quindi allineare un bordo della piastra dotata della pila di membrane in gel con un bordo del rizotrone aperto. Piegare delicatamente la piastra verso il terreno e utilizzare le guide e le viti per fissare la piastra al rizotrone.

Dopo il periodo di campionamento in solitudine, trasferire la piastra frontale dal rizotrone a una cappa a flusso laminare con il lato della pila di membrane in gel rivolto verso l'alto e rimuovere con cautela il nastro e la membrana in policarbonato che copre il gel. Applicare acqua per aiutare il gel a galleggiare liberamente su un sottile film d'acqua sulla piastra con il lato a contatto con il suolo rivolto verso l'alto e trasferire il gel su una membrana di polietersulfone con una dimensione dei pori di 0,45 micron e un supporto di carta assorbente. Dopo aver coperto la pila di gel con un foglio protettivo, posizionarla in un essiccatore di gel sottovuoto.

Quando il gel si è completamente asciugato, utilizzare del nastro biadesivo per fissare il gel secco insieme ad altri campioni di gel su una lastra di vetro. Per eseguire un'analisi di scansione lineare con spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente di ablazione laser dei gel DGT secchi, fissare prima i bianchi e gli standard del campione sullo stadio del campione di ablazione laser e bloccare lo stadio laser nella cella di ablazione del sistema di ablazione laser. Nel software di ablazione laser spostare la regione di interesse sulla superficie del gel e tracciare un'unica linea lunga circa un millilitro attraverso la superficie dello standard del gel.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla linea nella finestra dei modelli di scansione per verificare che i parametri di ablazione laser siano stati impostati e adottati e utilizzare lo strumento di duplicazione delle scansioni per duplicare questa linea quattro volte con una distanza di interlinea maggiore del diametro del punto. Dopo aver ripetuto questa linea per ogni bianco di calibrazione standard del gel e bianco del metodo, tracciare una singola linea lungo il bordo superiore dell'area rettangolare del campione di gel da analizzare e duplicare la linea per creare linee parallele per l'intera area del campione come dimostrato, utilizzando una distanza interlinea da 300 a 400 micrometri. Verificare che ogni punto iniziale e finale di ciascuna linea sia correttamente focalizzato sulla superficie del gel e fare clic su Analizza batch per avviare la sequenza del campione sullo spettrometro di massa al plasma accoppiato induttivamente.

Fare clic sull'emissione nella finestra di energia del laser per ricaricare la testa laser. Fare clic su Esegui per aprire la finestra Esegui esperimento e selezionare solo i modelli selezionati. Impostare il ritardo di lavaggio su 20-30 secondi.

Selezionare la casella laser abilitato durante le scansioni e impostare il tempo di riscaldamento del laser su 10 secondi. Quindi fare clic su Esegui e OK per avviare l'analisi della scansione della linea e monitorare l'intensità del segnale grezzo in conteggi al secondo per ciascun isotopo sullo spettrometro di massa al plasma accoppiato induttivamente in tempo reale. Ogni riga dovrebbe iniziare e terminare con un gas vuoto.

Dopo l'analisi, importare il file di dati grezzi per ogni linea ablata in un foglio di calcolo. La tabella dei dati grezzi mostra le letture della spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente per ciascun isotopo in conteggi al secondo e i corrispondenti punti temporali in secondi. Elenca tutte le righe una accanto all'altra in colonne diverse.

Calcolare un bianco di gas medio per ciascun isotopo da tutti i valori di bianco di gas registrati prima delle ablazioni di linea e sottrarre il bianco di gas medio dalle corrispondenti intensità grezze per ciascun isotopo per correggere il segnale di fondo. Per applicare la normalizzazione interna, dividere l'intensità del segnale corretto in bianco di gas di ciascun isotopo per l'intensità del segnale corretto in bianco di gas del carbonio standard interno 13 per ciascun punto dati per correggere le variazioni nella quantità di materiale ablato e la deriva strumentale. Ritagliare i dati prima dell'inizio e dopo la fine di ogni linea ablata per rimuovere il segnale di fondo vuoto del gas e trasporre la tabella dei dati per ottenere una matrice di griglia in cui ogni riga corrisponde a una linea ablata e ogni colonna corrisponde a un valore di intensità isotopica normalizzato.

Quindi applicare la funzione di calibrazione ottenuta dall'analisi degli standard di gel e salvare la matrice di dati calibrata come file di testo. Per generare un'immagine, importare la matrice di dati del campione calibrato nel software di analisi delle immagini come immagine di testo e applicare il fattore di correzione del rapporto d'aspetto e una tabella di ricerca per visualizzare i gradienti chimici nell'immagine del soluto. Regola il bilanciamento del colore dell'immagine per controllare i limiti inferiore e superiore dell'intervallo di visualizzazione, aggiungi una barra di calibrazione e salva l'immagine del soluto come file TIF.

Utilizzare il comando Copia nel sistema per copiare l'immagine solida e incollarla nel software di desktop publishing. Quindi abbina la scala, allinea e componi l'immagine solida con una foto della regione di interesse e le altre immagini del soluto. L'allineamento delle immagini del soluto con un'immagine fotografica della regione di interesse rivela che la distribuzione del flusso solido 2D sub-millimetrica dei diversi elementi è altamente variabile in base alla struttura del suolo e alla morfologia delle radici.

Ad esempio, in questa analisi di una giovane radice di grano saraceno coltivata in terreno privo di carbonati, fertilizzata con nitrato di ammonio, la distribuzione sub-millimetrica del soluto ha mostrato zone di diminuzione dei flussi di alluminio, fosforo e ferro accanto a sezioni radicali più vecchie a causa dell'assorbimento delle radici e flussi di magnesio, alluminio, fosforo, manganese e ferro altamente aumentati all'apice della radice a causa dei processi di mobilizzazione dei nutrienti localizzati. In questa analisi, si può osservare una distinta deplezione di zinco, cadmio e piombo nell'immediata posizione delle radici, illustrando che le radici della specie di salice tollerante ai metalli Salix smithiana agiscono come un pozzo localizzato per i metalli in tracce labili nel suolo contaminato. In questa analisi, la distribuzione dei metalli in tracce labili lungo le radici di Salix smithiana è stata co-localizzata con la distribuzione del pH, utilizzando un gel legante cationico combinato optodo planare a strato singolo-DGT.

Questa combinazione di metodi ha rivelato che l'aumento dei flussi di soluti di manganese, ferro, cobalto, nichel, rame e piombo era associato a una diminuzione del pH di circa un'unità, suggerendo la solubilizzazione del metallo indotta dal pH. È fondamentale garantire un contatto stretto e stabile tra lo strumento DGT e la superficie solida per evitare artefatti analitici. In caso di dubbio, ripetere la procedura di applicazione del gel.

Questo metodo può essere combinato con altre tecniche di imaging solido basate sulla diffusione, come gli optodi planari, per valutare simultaneamente una serie di parametri coinvolti nell'assorbimento degli elementi vegetali.