Un protocollo per l'immunoistochimica e la distribuzione dell'RNA in situ all'interno dell'embrione di drosofila precoce

Come organismo con un breve periodo gestazionale, gli embrioni di Drosophila melanogaster sono soggetti di studio primari per studiare la distribuzione e la localizzazione delle proteine e dei loro regolatori durante lo sviluppo. Tuttavia, a causa dei loro embrioni ricchi di lipidi e del coro ricco di chitina, la loro utilità è limitata dalla difficoltà di montare embrioni su superfici di vetro. In questo lavoro, introduciamo un metodo pratico che migliora significativamente l'attaccamento dell'embrione di Drosophila ai vetrini e dettaglia i nostri metodi per il successo dell'istochimica, dell'immunoistochimica e dell'ibridazione in situ.

Prima dei passaggi mostrati qui, le diapositive devono essere lavate con detergente, quindi risciacquate in acqua di rubinetto e acqua distillata prima di essere poste in forno ad asciugare. I vetrini asciutti devono essere delicatamente immersi in dicromato di potassio per 24 ore prima di essere risciacquati e asciugati di nuovo, quindi posti in etanolo al 95% per almeno due ore. Durante questo passaggio, è possibile preparare ulteriori diapositive o la gelatina di allume al cromo secondo i nostri metodi.

La gelatina può quindi essere conservata in acqua a bagno a 60 gradi prima dell'uso. Per rivestire le diapositive, far cadere una piccola quantità di gelatina su un bordo del vetrino. Quindi utilizzare un altro vetrino per trascinare lentamente e uniformemente la gelatina sulla superficie del vetrino da rivestire.

Questo crea uno strato sottile e uniforme. Prima di essere messo in una cremagliera o in un apparecchio di essiccazione da conservare in un forno per consentire l'asciugatura completa per un'altra notte o 48 ore. Gli embrioni vengono raccolti utilizzando un piatto di agar di succo d'uva, una volta pronto, il piatto di agar di succo d'uva può quindi essere rimosso.

Inondare la piastra con PBS e spazzolare delicatamente con una spazzola morbida per rimuovere eventuali embrioni attaccati. Rimuovere l'embrione contenente PBS in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e lasciarlo riposare sul ghiaccio. Una volta che l'embrione è stato depositato sul ghiaccio, rimuovere delicatamente il PBS surnatante.

Fare attenzione a non disturbare l'embrione nella parte inferiore del tubo. Aggiungere 1 mL di candeggina al 50% al campione e agitare delicatamente per due minuti. Rimuovere la candeggina mediante filtrazione e lavare gli embrioni in PBS tre volte.

Preparare n-eptano. Una volta pronti, lavare gli embrioni dalla carta da filtro in n-eptano agitando delicatamente la carta da filtro nella soluzione. Lasciare che gli embrioni si depositino sul fondo della piastra n-eptano e raccogliere questo n-eptano in un nuovo tubo centrifugo da 1,5 millilitri.

Aggiungere un millilitro di metanolo al tubo, lasciare precipitare la soluzione e quindi aspirare il metanolo n-eptano. Lavare l'embrione in PBS da tre a cinque volte per rimuovere il metanolo residuo. Rimuovi questo PBS extra e aggiungi il fissativo di Bouin e lascia riposare da 30 a 60 minuti per fissare gli embrioni.

Rimuovere il fissativo di Bouin e lavare nuovamente gli embrioni in PBS tre volte. Preparare l'1,2% di agarosio in PBS e tenere al caldo a bagnomaria a 60 gradi, quindi preparare gli embrioni per l'incorporamento aspirando delicatamente PBS extra in cui è stato conservato. Fare attenzione a non disturbare gli embrioni sul fondo, quindi aspirare il tappo dell'embrione sul fondo della soluzione e posizionarlo delicatamente in uno stampo per tappo di bottiglia.

Aspirare qualsiasi PBS aggiuntivo da questo stampo prima di aggiungere l'1,2% di gel di agarosio. Preparare una soluzione di PBS per conservare questi tappi di agarosio. Una volta che l'agarosio si è solidificato, le singole spine possono essere spostate in questo PBS per l'archiviazione.

Qui mostriamo il processo di disidratazione sequenziale. Lasciando 15 minuti per l'incubazione ogni volta. Quindi rimuovere dall'etanolo al 100% e fissare in una soluzione one-to-one di etanolo e xilene per altri 15 minuti.

Una volta rimosso da questa soluzione one-to-one, rimuovere in xilene puro per un minuto. Ora il campione di tessuto è pronto per essere spostato in una soluzione di paraffina di xilene uno a uno riscaldata. Lasciare riposare per 30 minuti prima dell'incorporazione finale in paraffina al 100%.

Passare al primo di 100% paraffina e riposare per due ore. Ripeti questo processo nelle sue due e tre paraffine. Il campione è ora pronto per essere spostato in uno stampo e lo stampo riempito di cera per completare il processo di incorporamento.

Incorporamento di embrioni di Drosophila. Mettere le sezioni di paraffina preparate di embrioni di Drosophila in un forno a 60 gradi per 15 minuti. Metterli in una soluzione al 100% di xilene.

Iniziamo quindi la reidratazione. Posizionare le diapositive in ciascuna di queste soluzioni per tre minuti ciascuna. Una volta che il vetrino è in acqua distillata, mettere nella soluzione di ematossilina per due minuti.

Una volta completato assicurarsi di drenare il più possibile la soluzione dal vetrino. Una volta che il vetrino è stato lavato in acqua distillata, quindi macchiare il vetrino in eosina per un minuto. Infine, rimuovere il vetrino dall'eosina e lavare in acqua distillata.

Una volta che questa diapositiva è pulita, iniziamo il nostro processo di disidratazione finale. Infine essere messo in 100% xilene per cinque minuti. Questo processo viene ripetuto in due nuove soluzioni di xilene al 100% e lascia cadere una piccola quantità di gomma neutra lungo un bordo della diapositiva.

Prendere questo coperchio scivolare e posizionare delicatamente su un bordo della diapositiva. Per prima cosa deparaffinizzare le diapositive inserendole in 100% xilene. Una volta rimossi i vetrini dall'acqua distillata, devono essere coperti con una soluzione acida periodica all'1%.

Quindi scartiamo la soluzione in eccesso e risciacquiamo in acqua distillata. Posizionando il vetrino direttamente in una soluzione preriscaldata. Una volta completato, risciacquiamo il vetrino in acqua distillata e quindi tingiamo la soluzione con cloruro d'oro allo 0,2% per uno o due minuti.

Successivamente, fissiamo il tessuto con il 3% di tiosolfato di sodio per tre minuti usando acqua distillata. E poi contromacchia con ematossilina. Dopo la controcolorazione, la macchia può essere lavata con entrambi i tubi di acqua distillata come mostrato qui.

Quindi passiamo al processo di disidratazione. Segui questo mettendo le diapositive direttamente in 100% xilene e quindi applica una piccola quantità di gomma neutra nell'angolo della diapositiva. Coprire delicatamente con un coperchio.

Iniziare a preparare i vetrini come in precedenza deparaffinizzando e xilene. E poi in etanolo xilene uno-a-uno. Una volta che i vetrini sono deparaffinati, iniziamo a reidratare il loro tessuto e infine in PBS.

Posizionare i vetrini in perossido di idrogeno allo 0,3% in metanolo per 10 minuti. Quindi le diapositive sono coperte con 20 ml di soluzione di recupero del bersaglio. Le diapositive possono quindi essere posizionate nella scatola di colorazione.

Posizionare la cassetta delle scale in un piroscafo, assicurandosi che nessuna soluzione sfugga e che le diapositive siano ancora completamente coperte. Si noti che il coperchio della scatola delle macchie non deve essere completamente chiuso in modo che il vapore acqueo possa fuoriuscire durante il processo di cottura a vapore. E poi risciacquare delicatamente in PBS-T tre volte.

Scartare la soluzione in eccesso e ripetere il processo, questa volta con PBS. Successivamente, incubamo i vetrini in un blocco di perossido per cinque-10 minuti e poi risciacquiamo più volte in PBS-T e poi in PBS. Preparare l'anticorpo e cadere direttamente sul tessuto.

Questi tessuti possono quindi essere incubati o a temperatura ambiente per quattro ore. L'anticorpo secondario deve essere incubato a temperatura ambiente per 90 minuti, che è la colorazione con 5% DAB per due a 10 minuti. Dopo aver ottenuto il colore appropriato, risciacquare in acqua distillata e quindi contromacchiare in ematossilina.

Dopo questa macchia di ematossilina, i vetrini possono quindi essere disidratati sequenzialmente. Posizionare i vetrini in 100% xilene e lasciare in ammollo per tre minuti. Quindi far cadere piccole quantità di gomma neutra su un bordo della diapositiva.

Una volta posizionata una gomma, prendere il coperchio del vetrino e posizionarlo delicatamente da un bordo del vetrino. Aggiungere un microgrammo di DNA modello linearizzato purificato a un flaconcino di reazione sterile privo di RNasi. Quindi aggiungere abbastanza acqua doppia distillata sterile trattata dePC senza RNasi per ottenere un volume totale del campione di 13 microlitri.

Quindi centrifugare brevemente e incubare per due ore a 37 gradi Celsius. Per gli esperimenti di protezione della RNasi, si consiglia l'incubazione per 15 minuti con due microlitri di Dnase-1, RNasi-free per rimuovere il DNA modello. Una volta completata la fase di incubazione, interrompere la reazione aggiungendo due microlitri di 0,2 EDTA molare a pH di otto.

Prima dei passaggi mostrati qui le diapositive sono state deparaffinate e reidratate, secondo il nostro protocollo precedentemente dimostrato. Dopo la reidratazione incubare i vetrini in 0,01 moli per litro PBS a pH di 7,4 per cinque minuti ciascuno per rimuovere la soluzione fissativa dal tessuto. Dopo il risciacquo in PBS, risciacquiamo con una soluzione di glicina da 100 millimolari per litro per cinque minuti due volte per rimuovere i gruppi di aldeide liberi dal tessuto.

Dopo questo passaggio, risciacquare i vetrini con PBS per cinque minuti. Quindi, incubare in PBS contenente 0,3% tritone X-100 per 15 minuti prima del risciacquo e quindi incubare di nuovo con un microgrammo per microlitro di proteinasi K.Successivamente, fissare i vetrini con paraformaldeide al 4% e PBS a pH di 7,2 per tre minuti. Quindi, lavare i vetrini prima di incubare con 0,1 tampone molare trietanolammina pH 8, contenente 0,25% anidride acetica.

È possibile scegliere di inclinare la scatola in questa fase per garantire una copertura completa con la soluzione. La scatola viene preparata aggiungendo il 20% di glicerolo o acqua DEPC sul fondo di una scatola di ibridazione a secco. Quindi, coprire le diapositive in 20 microlitri di soluzione di pre ibridazione.

DNA dello sperma del salmone ad una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro per ogni vetrino. E poi incubare a 42 gradi Celsius per quattro ore. Questo viene fatto in una scatola umidificata pre-preparata per garantire che la soluzione non si asciughi durante questo processo.

Nella fase post-ibridazione, è molto importante che la soluzione di ibridazione sia completamente risciacquata dai campioni. Questo può essere fatto in risciacqui consecutivi di 15 minuti a 37 gradi, utilizzando quattro volte la concentrazione SSC, due volte la concentrazione una volta la concentrazione, 0,5 volte la concentrazione e 0,1 volte la concentrazione SSC. Ogni incubazione per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo aver fatto questo, lavare con PBS tre volte per cinque minuti ciascuno prima di aggiungere il tampone di lavaggio. Il tampone di lavaggio deve essere risciacquato per un minuto prima dei passaggi successivi Assicurarsi che il tampone di lavaggio sia completamente asciutto dalle diapositive prima di aggiungere la soluzione successiva. Aggiungere 100 millilitri di soluzione bloccante a ciascun vetrino e incubare il vetrino per 30 minuti.

Questo è meglio farlo in un ambiente privo di luce per garantire una buona colorazione. Quindi incubare i vetrini per 30 minuti di nuovo in 20 ml di soluzione anticorpale. Applicare la soluzione anticorpale direttamente sui vetrini per una copertura completa del tessuto.

Una volta completata l'incubazione, applicare 100 millilitri di tampone di lavaggio. Incubare per 15 minuti in condizioni di luce libera per rimuovere i coniugati anticorpali non legati. Rimuovere il tampone di lavaggio.

Quindi, applicare 20 millilitri di tampone di rilevamento e lasciare incubare per circa quattro minuti. Dopo quattro minuti, rimuovere il buffer di rilevamento. Asciugare i vetrini per evitare soluzioni aggiuntive e aggiungere 10 millilitri di soluzione di substrato colorato appena preparata.

Questa reazione inizia entro pochi minuti, ma è completa dopo 16 ore. Quindi lascia incubare per quel periodo di tempo in una condizione di luce libera. Una volta individuati i punti desiderati in cui vengono rilevate le bande, lavare il vetrino con 50 millilitri di tampone TE per fermare la reazione.

E poi completare il nostro processo di disidratazione precedentemente mostrato e il processo di montaggio per la gomma neutra. Le figure uno e due dimostrano il metodo di rivestimento della gelatina di alluminio cromato per le sezioni di paraffina e il metodo di incorporamento per il profilo di espressione di FKBP12 e DmFKBP12 nello sviluppo di embrioni di Drosophila. La figura tre mostra la distribuzione proteica degli anticorpi rilevati FKBP12 negli stadi del blastoderma cellulare sinciziale.

Da questi risultati istochimici, si può vedere che l'espressione di FKBP12 è meno polarizzata nel blastoderma sinciziale, quindi inizia a localizzarsi all'interno della membrana basale sotto l'epitelio del trofoectoderma informa il gradiente con più espressione trovata nei poli anteriore e posteriore. La figura quattro, che segue le fasi iniziali e tardive della relazione gassosa dell'embrione di Drosophila, mostra che la proteina FKBP12 si limita a determinati componenti architettonici del tessuto embrionale primitivo. Con una distribuzione extracellulare inferiore a quella osservata nelle fasi embrionali gastro embrionali precoci e tardive.

È interessante notare che la distribuzione dinamica delle proteine sopra descritta non è accompagnata da corrispondenti cambiamenti nei livelli mrI di FKBP12 come visto nella figura cinque. Indicare che l'espressione proteica è il risultato di un meccanismo molecolare post-trascrizionale ancora sconosciuto. La segnalazione del calcio mediata dal recettore della rianodina è una via fondamentale in molti processi fisiologici e patologici di animali vertebrati e invertebrati.

Le mutazioni in questo gene sono note per causare molti disturbi fisiologici che portano a malattie o morte cardiaca precoce. Tuttavia, il ruolo che questo gene svolge nello sviluppo precoce di Drosophila è stato difficile da studiare. Come componente di transito dell'embrione, l'embrione ricco di lipidi e il corion ricco di chitina, rendono difficili gli studi sull'espressione proteica ed embrionale nello sviluppo precoce della Drosophila.

Il rivestimento del vetrino, l'incorporamento dell'embrione e le tecniche immunoistochimiche descritte in questo articolo ci hanno permesso di studiare in dettaglio la distribuzione dinamica della proteina del recettore della rianodina e dell'mRNA. Condividiamo queste tecniche e la speranza che permetteranno ad altri di studiare altre proteine durante le prime fasi di sviluppo della Drosophila.