Name: Un protocollo per limmunoistochimica e la distribuzione dellRNA in situ allinterno dellembrione di drosofila precoce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: Impara l'immunoistochimica e l'ibridazione in situ per localizzare proteine e RNA in embrioni di Drosophila melanogaster. Questo protocollo migliora l'adesione dei campioni alle vetrini per una visualizzazione ottimale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (#31771377/ 31571273/31371256), dal Foreign Distinguished Scientist Program del National Department of Education (#MS2014SXSF038), dal National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) e XZ è supportato da Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), il Natural Science Basic Research Program Youth Project del Dipartimento Provinciale di Scienza e Tecnologia dello Shaanxi (#2020JQ-885).

1. Preparazione di piatti di agar di succo d'uva
<ol><li>Aggiungere 5 g di agar e 5 g di saccarosio a 150 ml di acqua distillata. Farlo bollire usando un forno a microonde fino a quando l'agar e il saccarosio sono completamente sciolti. Mescolare 50 ml di succo d'uva al 100% e la soluzione insieme.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di acido propionico al 100% per rendere la concentrazione finale allo 0,5% di acido propionico. Versare 25 ml della soluzione preparata in ogni piastra. Dopo che l'agar si è solidificato, conservare il supporto a 4 °C.</li>
</ol>2. Vetrini di rivestimento
<ol><li>Pretrattare i vetrini con detergente. Lavare gli scivoli 3 volte con acqua di rubinetto e una volta con acqua distillata. Quindi asciugare i vetrini in un forno a 45 °C per 2 ore.</li>
	<li>Immergere i vetrini in circa 450 ml di soluzione di acido solforico dicromato di potassio (20 g di dicromato di potassio, 40 ml di acqua distillata e 400 ml di acido solforico concentrato) per 24 ore. Lavare gli scivoli 3 volte con acqua di rubinetto e una volta con acqua distillata.<ol>
<li>Asciugare i vetrini in forno a 45 °C per due ore. Immergere in etanolo al 95% per più di 2 ore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 0,5 g di solfato di cromopotassico e 5 g di gelatina a 1 L di acqua distillata. Sciogliere a bagnomaria a 60 °C prima dell'uso. La gelatina di cromo allume può essere conservata a 4 °C per lunghi periodi.</li>
	<li>Far cadere 10 μL di gelatina di cromo allume sul vetrino e coprire completamente e uniformemente l'intera superficie del vetrino con la soluzione. Mettere il vetrino con il lato gelatina in forno a 42 °C per 48 ore. I vetrini preparati possono essere conservati a 4 °C per un uso successivo. NOTA: questo è un passaggio critico. Il rivestimento completo è necessario. Per il moscerino della frutta e il suo embrione, questo approccio di rivestimento a vetrino sembra più efficiente del rivestimento in polilisina.</li>
</ol>3. Incorporamento dell'embrione di Drosophila
<ol><li>
Raccolta di embrioni di Drosophila NOTA: Abbiamo raccolto embrioni di Drosophila in quattro periodi di 0-2 ore (blastoderma sinciziale), 2-3 ore (blastoderma cellulare), 3-12 ore (gastrula precoce) e 12-24 ore (gastrula tardiva)18. La proporzione dei principali tipi di embrioni in ciascun periodo è riportata nella Tabella 1.<ol>
<li>Metti 400-500 mosche in una bottiglia di raccolta di plastica e copri la bottiglia con il piatto di agar di succo d'uva contenente estratto di lievito. Gli embrioni di Drosophila vengono deposti sul succo d'uva agar a temperatura ambiente.</li>
		<li>Raccogliere quattro periodi di embrioni, aggiungendo delicatamente 2 ml di PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) a ciascuna piastra per far galleggiare gli embrioni. Trasferire circa 200 embrioni in un tubo di centrifuga da 50 ml e tenerlo sul ghiaccio per 2 minuti per sistemare gli embrioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pre-incorporamento<ol>
<li>Trasferire 200 embrioni di Drosophila in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio per 2 minuti per sistemare gli embrioni, quindi scartare con cura il surnatante con la pipetta. Aggiungere 1 mL di candeggina al 50% nel tubo e agitare delicatamente per 2 minuti. NOTA: La candeggina deve essere preparata fresca e la quantità di candeggina potrebbe variare a seconda della quantità di embrioni raccolti.</li>
		<li>Raccogliere delicatamente gli embrioni versandoli su carta da filtro e lavarli 3 volte con 1 ml di PBS alla volta.</li>
		<li>Trasferire gli embrioni con carta da filtro a circa 5 ml di n-eptano.</li>
		<li>Trasferire la miscela in un tubo centrifugo fresco da 1,5 ml. Aggiungere 1 ml di metanolo e agitare delicatamente. Raccogliere gli embrioni dopo la sedimentazione.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante e lavare gli embrioni in 1 ml di PBS 3-5 volte.</li>
		<li>Fissare gli embrioni con 400 μL di soluzione di Bouin (71% di acido picrico saturo, 24% formalina, 5% acido acetico) per 30 minuti. Lavare gli embrioni fissi 3 volte in 1 ml di PBS per 5 minuti ogni volta.</li>
		<li>Per aggregare gli embrioni, trasferire i campioni in un tappo di gomma e rimuovere il PBS.</li>
		<li>Preparare la soluzione di agarosio-PBS all'1,2% e mantenere la soluzione a 60 °C. Aggiungere 200 μL di soluzione di agarosio-PBS all'1,2% sugli embrioni per fissarli in un blocco di agar.</li>
		<li>Togliere il blocco dal tappo e memorizzare il blocco in PBS. NOTA: durante l'approccio di pre-incorporamento, pro-riscaldamento è fondamentale per il successo. Consigliamo vivamente che i tubi della centrifuga e le punte delle micropipette, che verranno utilizzati in questa fase, siano completamente preriscaldati prima del funzionamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incorporamento di paraffina<ol>
<li>Immergere il blocco di agar pre-incorporato in etanolo al 35%, etanolo al 50%, etanolo al 75% etanolo all'85% per 15 minuti ciascuno. Quindi immergere 2 volte in etanolo al 95% e etanolo al 100%. NOTE: Circa 5-10x di volume di blocco di ciascuno seguito da un fissativo graduato per 15-30 minuti è necessario a seconda del numero di embrioni nel blocco.</li>
		<li>Immergere il blocco embrionale in soluzione di etanolo al 100% e xilene (rapporto 1:1) per 15 minuti.</li>
		<li>Trasferire il blocco in xilene per 1 minuto per rendere trasparente il tessuto embrionale.</li>
		<li>Immergere il blocco in xilene e paraffina (rapporto 1:1) per 30 min.</li>
		<li>Immergere il blocco in paraffina I, paraffina II e paraffina III per 2 ore ogni volta.</li>
		<li>Riempi la casella di incorporamento con paraffina in anticipo, quindi trasferisci delicatamente e orizzontalmente il blocco nella parte inferiore della scatola di incorporamento. Dopo che la paraffina si è solidificata naturalmente, il blocco di paraffina solidificato può essere conservato a 4 °C. NOTE: Il campione pre-incorporato può essere utilizzato in criosezione seguendo i seguenti passaggi. Dopo che gli embrioni sono pre-incorporati con agarosio come descritto sopra, i campioni sono semplicemente incorporati in OCT Compound. Successivamente, la criosezione può essere eseguita secondo il protocollo di criosezione di routine. Successivamente, è possibile utilizzare approcci di colorazione regolari sulle sezioni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Colorazione dell'ematossilina-eosina
<ol><li>Preparare sezioni di embrioni di Drosophila . Mettere le sezioni preparate in forno a 60 °C per 15 minuti e poi immergere le sezioni in xilene 2 volte per 10 minuti ciascuna. Immergere le sezioni una volta in etanolo al 100% e xilene (rapporto 1:1) per 2 min.</li>
	<li>Idratare le sezioni in etanolo I al 100%, etanolo II al 100%, etanolo al 95%, etanolo all'85%, etanolo al 75%, etanolo al 50% e in acqua distillata per 3 minuti.</li>
	<li>Macchiare le sezioni con soluzione di ematossilina per 2 minuti. Immergere rapidamente i vetrini in soluzione alcolica acida all'1% (1 mL di acido cloridrico, 100 ml di etanolo al 70%) e lavare i vetrini in acqua distillata.</li>
	<li>Immergere i vetrini in etanolo al 50%, etanolo al 75%, etanolo all'85% etanolo al 95% in sequenza.</li>
	<li>Macchiare le sezioni con soluzione di eosina per 1 min.</li>
	<li>Disidratare i vetrini in etanolo I al 95%, etanolo II al 95%, etanolo III al 95%, etanolo I al 100%, etanolo II al 100% e etanolo III al 100% per 1 minuto ogni volta.</li>
	<li>Pulire le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 5 minuti ogni volta.</li>
	<li>Montare le diapositive con balsamo neutro secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>5. Colorazione periodica acido-argento metenamina
<ol><li>Deparaffinizzare e idratare le sezioni di paraffina dell'embrione di Drosophila in acqua distillata.</li>
	<li>Ossidare le sezioni in acido periodico all'1% per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risciacquare i vetrini in acqua distillata 3 volte per 1 minuto ciascuno.</li>
	<li>Incubare i vetrini in circa 40 ml di soluzione di lavoro di metenamina d'argento appena filtrata (3% metenamina, 5% nitrato d'argento, soluzione di borato di sodio al 5%) per 1 ora e 20 minuti a 60 °C. Quindi risciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto.</li>
	<li>Tonificare i vetrini in cloruro d'oro allo 0,2% per 2 minuti e quindi risciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto.</li>
	<li>Posizionare i vetrini in tiosolfato di sodio al 3% per 3 minuti e quindi risciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto.</li>
	<li>Controbattere le diapositive in ematossilina per 30 s. Lavare gli scivoli in acqua corrente del rubinetto per 3-5 minuti.</li>
	<li>Disidratare i vetrini in etanolo al 70%, etanolo all'80%, etanolo I al 95%, etanolo II al 95%, etanolo III al 95%, etanolo I al 100% etanolo II al 100% per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Pulire le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 5 minuti ciascuna.</li>
	<li>Montare le diapositive in balsamo neutro secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>6. Immunoistochimica
<ol><li>Deparaffinizzare e reidratare le sezioni di paraffina dell'embrione di Drosophila in PBS seguendo il protocollo standard19.</li>
	<li>Trattare i vetrini con 0,3% di H2O2 in metanolo per 10 minuti a temperatura ambiente ed evitare la luce.</li>
	<li>Preriscaldare il tampone di recupero dell'antigene appropriato a circa 100 °C in un contenitore con i vetrini nel piroscafo vegetale. Il contenitore dovrebbe anche avere un coperchio. Metti le diapositive nel contenitore. Chiudere il coperchio del piroscafo.<ol>
<li>Tenere il contenitore nel piroscafo per 20 minuti da questo punto. Si noti che il coperchio del contenitore a scorrimento non deve essere completamente stretto in modo che il vapore acqueo possa entrare durante il processo di cottura a vapore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lasciare che i vetrini tornino a temperatura ambiente prima di risciacquarli delicatamente in PBS-T (PBS con Tween-20, pH 7,2) 3 volte per 5 minuti ciascuno, quindi risciacquare i vetrini in PBS 3 volte per 1 minuto ciascuno.</li>
	<li>Bloccare i vetrini con l'1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS per 60 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare i vetrini con anticorpo primario (anti-FKBP12 a 1:1000) durante la notte a 4 °C o a temperatura ambiente per 4 ore.</li>
	<li>Lavare le diapositive in PBS-T 4 volte per 5 minuti ciascuna.</li>
	<li>Applicare i vetrini con polimero marcato HRP coniugato con anticorpi secondari (anti-Rabbit, 1:5.000) per 90 min a temperatura ambiente. Fallo al buio per evitare lo sbiancamento delle foto.</li>
	<li>Lavare i vetrini in PBS-T 3 volte per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Incubare i vetrini con il 5% di 3,3'-diaminobenzidina-tetracloridrato (DAB) per 2-10 minuti fino a quando il colore dei prodotti di reazione è appropriato al microscopio.</li>
	<li>Controbattere i vetrini in ematossilina per 30 s e lavare i vetrini in acqua distillata 2 volte per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Disidratare i vetrini in etanolo al 50%, etanolo al 70%, etanolo al 90%, etanolo al 95% ed etanolo al 100% per 1 minuto ciascuno.</li>
	<li>Pulire le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 5 minuti ciascuna.</li>
	<li>Montare le diapositive in balsamo neutro secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>7. Ibridazione in situ 
NOTA: le sezioni di embrione di Drosophila sono state preparate con acqua trattata con pirocarbonato di dietile (DEPC) allo 0,01%. Tutti gli accessori utilizzati per l'ibridazione in situ applicano in anticipo il trattamento notturno DEPC.
<ol><li>Preparazione del riboprobo<ol>
<li>Linearizzare il DNA del modello tagliando in un sito enzimatico di restrizione a valle dell'inserto clonato utilizzando un enzima di restrizione che crea sporgenze di 5 '. Dopo la linearizzazione, purificare il DNA del modello tramite estrazione di fenolo / cloroformio e successiva precipitazione di etanolo. Utilizzare protocolli standard.</li>
		<li>Aggiungere 1 μg di DNA modello purificato a un tubo centrifugo privo di RNasi. Posizionare il tubo della centrifuga sul ghiaccio. Aggiungere abbastanza acqua trattata con DEPC al volume totale di 13 μL.<ol>
<li>Quindi aggiungere i seguenti reagenti nell'ordine: 2 μL di 10x miscela di etichettatura NTP, 2 μL di 10x tampone di trascrizione, 1 μL di inibitore della RNasi protettore, 2 μL di RNA polimerasi SP6 o RNA polimerasi T7.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mescolare la reazione mediante pipettaggio e centrifuga a breve. Incubare per 2 ore a 37 °C. NOTA: incubazioni più lunghe non aumentano la resa dell'RNA marcato. Una breve rotazione (~ 800 giri / min) applicata sul tubo di reazione è fondamentale prima di continuare con il passaggio successivo. Questo spin permetterà a tutti i contenuti, che potrebbero generare dall'incubazione, di arrivare sul fondo del tubo.</li>
		<li>Aggiungere 2 μL di DNasi I priva di RNasi per rimuovere il DNA modello e incubare per 15 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Aggiungere 2 μL di 200 mM EDTA (pH 8,0) per arrestare la reazione. NOTA: le sonde di RNA marcate DIG possono essere conservate a -15-22 °C in etanolo per un anno.</li>
	</ol></li>
	<li>Pre-ibridazione della sezione embrionale di Drosophila<ol>
<li>Mettere sezioni di embrione di Drosophila in un forno a 42 °C per 48 ore.</li>
		<li>Deparaffinizzare le diapositive in 100% xilene per 10 minuti due volte.</li>
		<li>Idratare i vetrini immergendo sequenzialmente in etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 90%, etanolo al 70% ed etanolo al 50% per 5 minuti.</li>
		<li>Incubare i vetrini in PBS per 5 minuti e 3 volte per rimuovere la soluzione fissativa / soluzione di Bouin dal tessuto.</li>
		<li>Lavare i vetrini con 100 mmol/L glicina/PBS soluzione 2 volte per 5 minuti ciascuno.</li>
		<li>Lavare le diapositive con PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.</li>
		<li>Incubare i vetrini con 0,3% Triton X-100 in PBS per 15 minuti per permeabilizzare le membrane.</li>
		<li>Lavare le diapositive con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuna.</li>
		<li>Incubare i vetrini in 15 μg/mL di proteinasi K priva di RNasi per 30 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Incubare i vetrini con il 4% di paraformaldeide in PBS per 3 minuti per fermare la digestione.</li>
		<li>Lavare le diapositive con PBS 2 volte per 5 minuti ciascuna.</li>
		<li>Incubare i vetrini in tampone trietanolammina da 100 mM (pH 8,0) con anidride acetica allo 0,25% (v/v) 2 volte per 5 minuti ciascuno.</li>
		<li>Aggiungere acqua DEPC nella camera di umidità della diapositiva. Aggiungere 20 μL di soluzione di pre-ibridazione (contenente 100 μg/mL di DNA di spermatozoi di salmone) sui vetrini. Mettere le diapositive nella camera di umidità della diapositiva. Incubare i vetrini a 42 °C per 4 ore. NOTA: È necessario garantire la tenuta del coperchio della scatola bagnata e che la scatola bagnata sia sempre tenuta in orizzontale per evitare volatilizzazione e deviazione dal tessuto della soluzione di pre-ibridazione e della soluzione di ibridazione seguita.</li>
	</ol></li>
	<li>Ibridazione del comparto embrionale di Drosophila<ol>
<li>Rimuovere la soluzione di pre-ibridazione e lavare i vetrini con 0,2x SSC (150 mM di cloruro di sodio, 15 mM di citrato di sodio, pH 7,0) 3 volte per 5 minuti ciascuno. Pulire l'eccesso di SSC 0,2x intorno ai campioni di tessuto.</li>
		<li>Applicare 30 μL di soluzione di ibridazione della sonda (contenente 2-6 ng di sonda di RNA marcata con digossina diluendo in soluzione di pre-ibridazione) con una pipetta. Incubare i vetrini nella camera di umidità del vetrino a 42 °C per circa 20 ore. NOTA: Assicurarsi della tenuta del cappuccio come suggerimento dell'ultima nota. Altrimenti, il prosciugamento causato dalla perdita di pre-ibridazione o pre-ibridazione genererà uno sfondo sporco incluso pseudo-positivo nelle diapositive.</li>
	</ol></li>
	<li>Ibridazione<ol>
<li>Rimuovere la soluzione di ibridazione e lavare i vetrini con 4x soluzione SSC 4 volte per 15 minuti ciascuno a 37 °C.</li>
		<li>Lavare i vetrini in 2x soluzione SSC con 20 μg/mL di RNasi A per 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Lavare i vetrini in 1 soluzione SSC per 15 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Lavare i vetrini in soluzione SSC 0,5x per 15 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Lavare i vetrini in soluzione SSC 0,1x per 15 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Lavare le diapositive con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuna.</li>
		<li>Lavare i vetrini nel tampone di lavaggio (100 mM di acido maleico, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) per 1 min.</li>
		<li>Incubare i vetrini in 100 ml di soluzione bloccante appena preparata (siero di pecora al 2% in tampone di acido maleico senza Tween 20) per 30 minuti.</li>
		<li>Incubare i vetrini in 20 ml di soluzione anticorpale per 45 minuti.<ol>
<li>Centrifugare l'anticorpo per 5 minuti a 10.000 giri/min nel flaconcino originale prima di ogni utilizzo e pipettare con attenzione la quantità necessaria dalla superficie. Anti-digoxigenina-AP diluita 1:5000 (150 mU/mL) in soluzione bloccante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lavare i vetrini in 100 ml di tampone di lavaggio 2 volte per 15 minuti ciascuno per rimuovere il coniugato anticorpale non legato.</li>
		<li>Equilibrare le diapositive in 20 mL di tampone di rilevamento (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) per 2-5 min.</li>
		<li>Incubare i vetrini con 10 ml di soluzione di substrato colorato appena preparata nella camera di umidità del vetrino. La reazione inizia entro pochi minuti ed è completa dopo 16 ore. Non agitare o mescolare mentre il colore si sta sviluppando.</li>
		<li>Lavare i vetrini con 50 ml di acqua distillata per 5 minuti per fermare la reazione.</li>
		<li>Asciugare il campione durante la notte al buio.</li>
		<li>Disidratare i vetrini in 70% etanolo, 80% etanolo, 90% etanolo, 95% etanolo, 100% etanolo I e 100% etanolo II per 3 minuti ciascuno.</li>
		<li>Cancellare le diapositive in 100% xilene I, 100% xilene II e 100% xilene III per 20 minuti ciascuna.</li>
		<li>Montare gli scivoli con balsamo neutro.</li>
		<li>Documenta le immagini e analizzale con la microscopia invertita e il software del produttore. Eseguire l'analisi della distribuzione utilizzando ImageJ in base alla densità del segnale positivo lungo l'asse longitudinale o all'interno della zona differenziale degli embrioni. NOTA: Durante l'incubazione con la soluzione di substrato colorante appena preparata nel passaggio 7.4.12, il colore della reazione può essere visto anche ad occhio nudo. Questa osservazione su come lo sviluppo del colore può essere ispezionata sotto stereoscopio. Una volta che il colore della reazione è ragionevole e il passaggio 7.4.13 può essere eseguito per fermare la reazione.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La segnalazione del calcio mediata da RyR e IP3R è una via fondamentale in molti processi fisiologici e patologici di animali vertebrati e invertebrati1,2,3,4. Nell'uomo, le mutazioni puntiformi, come la mutazione R4496C associata a CPVT, nel gene RyR2 portano alla fuoriuscita di calcio dal reticolo sarcoplasmatico dei cardiomiociti, con conseguente disfunzione cardiaca. Queste mutazioni si pre...

La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici, come la funzione scheletrica/muscolare liscia e la funzione vascolare cardiaca, la proliferazione cellulare e l'apoptosi, lo sviluppo, l'invecchiamento, la plasticità sinaptica neuronale e la rigenerazione1,2,3,4,5,6 . I recettori della rianodina (RyRs) e i recettori dell'inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3R) sono i principali attori nella via di segnalazione del calcio controllata dai loro regolatori proteina chinasi A (PKA), Ca2+ / calmodulina-dipendente proteina chinasi II (CaMKII), FK506 proteine leganti (FKBPs), calsequestrina (CSQ), triadina e junctin1,2,3,4,5,6 . L'espressione umana anomala e le mutazioni in queste proteine possono portare a fisiologia patologica come aritmie7 e proliferazione oncogenica8,9.
Le FKBP regolano il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico (ER) da parte dei RyR. Questo processo è essenziale per il meccanismo di contrazione, e quindi responsabile di tutti i movimenti meccanici generati dalla contrazione della miosina-actina attraverso il rilascio di calcio indotto dal calcio insieme ai RyR embrionali1,2. Nei modelli murini, la mancanza di RyR2 e del suo regolatore FKBP12/Calstabin è invariabilmente letale, sia durante lo sviluppo embrionale che nel primo periodo postnatale10,11,12. I topi knockout FKBP12/Calstabin presentano difetti cardiaci critici con accoppiamento irregolare eccitazione-contrazione (EC) ed edema cerebrale durante lo sviluppo embrionale. Ciò indica che FKBP12/Calstabin svolge un ruolo essenziale nella regolazione dell'espressione del canale RyR2, che è importante sia per lo sviluppo cardiaco che cerebrale10.
Le scintille di calcio condotte da RyR sono state inizialmente scoperte nella fase di formazione dello zigote delle uova medaka fecondate13,14. Tuttavia, poche indagini sono state eseguite sulla funzione della segnalazione del calcio nello sviluppo embrionale precoce. In Drosophila melanogaster, i risultati ottenuti dai mutanti DmFKBP12 S107 forniscono una forte evidenza a sostegno dell'importanza di questo gene per lo sviluppo larvale e una durata di vita sana, che è attribuita alla sua funzione contro lo stress ossidativo15,16. Recentemente, abbiamo identificato la localizzazione dinamica della proteina FKBP12/Calstabin e dell'RNA messaggero durante lo sviluppo precoce di Drosophila melanogaster17. Utilizzando gli approcci descritti in questa metodologia, siamo stati in grado di tracciare l'espressione di FKBP12 / Calstabin in D. melanogaster durante il blastoderma sinciziale (0-2 h), il blastoderma cellulare (2-3 h), la gastrula precoce (3-12 h) e la gastrula tardiva (12-24 h). In questo articolo, presentiamo i protocolli dettagliati di ogni approccio nello studio precedente, tra cui l'incorporamento pre-embrionale per il sezionamento classico di paraffina, il trattamento con vetrini pre-rivestimento per sezioni embrionali, la colorazione istochimica e l'immunocolorazione e l'ibridazione in situ dell'mRNA per l'identificazione dell'espressione genica.

<table><tbody><tr><td>-20&deg; C Frigorifero</td><td>Meiling Biologia & Medico</td><td>DW-YL270</td><td>Utilizzato per lo stoccaggio reggente-80</td></tr><tr><td>&deg; C Frigorifero a bassissima temperatura</td><td>Thermo</td><td>Forma 90 Series</td><td>Utilizzato per la conservazione dei reggenti</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBB6360V</td><td>Preparazione di piastre di agar per succo d'uva</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-AP, frammenti Fab Roche</td><td></td><td>11093274910</td><td>Per la rilevazione di composti marcati con digossigenina</td></tr><tr><td>Incubatore biochimico</td><td>Shanghai Bluepard Instruments</td><td>LRH-250</td><td>In-situ Ibridazione</td></tr> Soluzione di <tr><td>Bouin</td><td>Reagente chimico Sinopharm a Pechino</td><td>69945460</td><td>Centrifuga per inclusione di embrioni di Drosophila</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>540BH07808</td><td>In-situ Ibridazione</td></tr><tr><td>Provetta per centrifuga</td><td>Denville</td><td>C-2170</td><td>Raccolta di embrioni di Drosophila</td></tr><tr><td>Allume di cromo</td><td>Sinopharm Reagente chimico presso Pechino</td><td>10001018</td><td>Coating Slides</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua a temperatura costante</td><td>Jintan Henfeng Instruments</td><td>KW-1000DC</td><td>Colorazione ematossilina-eosina, immunoistochimica, ibridazione in situ e colorazione periodica acido-argento metenamina Dako</td></tr><tr><td>REAL EnVision Detection System</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td>Nella reazione immunoistochimica o nella reazione di ibridazione in situ, si lega all'anticorpo dell'antigene primario e il bersaglio viene marcato mediante colorazione.</td></tr>Kit di etichettatura dell'RNA DIG di <tr><td>ibridazione in situ</td> <td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>la marcatura dell'RNA con diagoxigenina-UTP mediante trascrizione in vitro con RNA polimerasi SP6 e T7</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td><td>Le scorte di Drosophila melanogaster mutant</td></tr><tr><td>Forno elettrico di essiccazione</td><td>Tianjin Taiste Instruments</td><td>101-0AB</td><td>Per vetrini di rivestimento e inclusione di paraffina</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251</td><td>Colorazione con ematossilina-eosina</td></tr><tr><td></td><td>Reagente chimico Sinopharm a Pechino</td><td>100092680</td><td>Inclusione di paraffina, colorazione ematossilina-eosina, immunoistochimica, ibridazione in situ e colorazione periodica acido-argento metenamina</td></tr><tr><td></td><td>Gelatina Sinopharm Reagente Chimico a Pechino</td><td>10010328</td><td>Rivestimento Vetrini</td></tr><tr><td>Cloruro d'oro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379948</td><td>Periodico Acido-Argento Metenamina Colorazione</td></tr><tr><td>Ematossilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td>Ematossilina-Eosina Colorazione</td></tr><tr><td>PCR ad alta purezza Kit di purificazione del prodotto</td><td>Roche</td><td>11732668001</td><td>Per la purificazione dei prodotti</td></tr> <tr><td>PCRScatola intelligente per la temperatura e l'umidità costanti</td><td>Ningbo Jiangnan Instruments</td><td>HWS</td><td>Per la manutenzione delle mosche</td></tr><tr><td>LE Agarosio</td><td>HyAgarose</td><td>14190108029</td><td>Pre-inclusione</td></tr><tr><td>del metanolo</td><td>Sinopharm Reagente chimico a Pechino</td><td>10014108</td><td>Microscopio per la raccolta di embrioni di Drosophila</td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td>Observer.A1</td><td>Colorazione con ematossilina-eosina, immunoistochimica, ibridazione in situ e colorazione periodica acido-argento metenamina</td></tr><tr><td>vetrini per microscopio</td><td>MeVid Labware Manufacturing</td><td>P105-2001</td><td>Vetrini per rivestimento</td></tr><tr><td>Gomma neutra</td><td>Sinopharm a Pechino</td><td>10004160</td><td>Colorazione con ematossilina-eosina</td></tr><tr><td>N-eptano</td><td>Sinopharm Reagente chimico a Pechino</td><td>40026768</td><td>Drosophila Affettatrice</td></tr><tr><td>per paraffina</td> da collezione <td>Strumento scientifico Huahai</td><td>HH-2508III</td><<td>em>In-situ Reagente</td></tr><tr>chimico per<td>ibridazione Paraffina</td><td>Sinopharm a Pechino</td><td>69019461</td> Misuratore di pH/mV per <td>inclusione in paraffina</td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td>PB-10</td><td>Per determinare il valore del pH di una soluzione</td></tr><tr><td>Nitrato d'argento</td><td>Reagente chimico Sinopharm a Pechino</td><td>10018461</td><td>Contatore di acqua ultrapura per colorazione periodica acido-argento metenammina</td></tr><tr><td></td><td>Thermo</td><td>AFXI-0501-P</td><td>In-situ Ibridazione</td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Sinopharm Reagente chimico a Pechino</td><td>10023418</td><td>Inclusione di paraffina</td></tr></tbody></table>

un protocollo per l'immunoistochimica e la distribuzione dell'rna in situ all'interno dell'embrione di drosofila precoce

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici. Ogni attività cellulare dalla proliferazione cellulare e apoptosi, allo sviluppo e all'invecchiamento, alla plasticità sinaptica neuronale e alla rigenerazione è stata associata ai recettori della rianodina (RyRs). Nonostante l'importanza della segnalazione del calcio, l'esatto meccanismo della sua funzione nello sviluppo iniziale non è chiaro. Come organismo con un breve periodo gestazionale, gli embrioni di Drosophila melanogaster sono soggetti di studio primari per studiare la distribuzione e la localizzazione delle proteine associate al CICR e dei loro regolatori durante lo sviluppo. Tuttavia, a causa dei loro embrioni ricchi di lipidi e del coro ricco di chitina, la loro utilità è limitata dalla difficoltà di montare embrioni su superfici di vetro. In questo lavoro, introduciamo un protocollo pratico che migliora significativamente l'attaccamento dell'embrione di Drosophila su vetrini e metodi di dettaglio per il successo dell'istochimica, dell'immunoistochimica e dell'ibridazione in situ . Il metodo di rivestimento del vetrino della gelatina di allume di cromo e il metodo di pre-incorporamento dell'embrione aumentano notevolmente la resa nello studio della proteina embrionale di Drosophila e dell'espressione dell'RNA. Per dimostrare questo approccio, abbiamo studiato DmFKBP12 / Calstabin, un noto regolatore di RyR durante lo sviluppo embrionale precoce di Drosophila melanogaster. Abbiamo identificato DmFKBP12 già nello stadio sinciziale del blastoderma e riportato il modello di espressione dinamica di DmFKBP12 durante lo sviluppo: inizialmente come proteina uniformemente distribuita nel blastoderma sinciziale, quindi localizzando preliminarmente nello strato basale della corteccia durante il blastoderma cellulare, prima di distribuirsi nell'architettura neuronale e digestiva primitiva durante la fase dello strato di tre gemme nella gastrulazione precoce. Questa distribuzione può spiegare il ruolo critico che RyR svolge nei sistemi di organi vitali che hanno origine da questi strati: il ganglio subesofageo e sopraesofageo, il sistema nervoso ventrale e il sistema muscolo-scheletrico.

Le figure descrivono i protocolli utilizzati per superare la sfida di attaccare embrioni di Drosophila ad alto contenuto di lipidi e chitina (Tabella 1) alla superficie del vetrino per l'esame e la sperimentazione. Utilizzando il metodo di rivestimento dei vetrini di gelatina di allume cromato mostrato nella Figura 1, abbiamo migliorato l'attaccamento degli embrioni di Drosophila sulla superficie dei vetrini, mentre il metodo di pre-incorporamento dell'embr...

Qui, descriviamo un protocollo per il rilevamento e la localizzazione della proteina embrionale di Drosophila e dell'RNA dalla raccolta al pre-incorporamento e incorporamento, all'immunocolorazione e all'ibridazione in situ dell'mRNA.

Un protocollo per l'immunoistochimica e la distribuzione dell'RNA in situ all'interno dell'embrione di drosofila precoce

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Come organismo con un breve periodo gestazionale, gli embrioni di Drosophila melanogaster sono soggetti di studio primari per studiare la distribuzione e la localizzazione delle proteine e dei loro regolatori durante lo sviluppo. Tuttavia, a causa dei loro embrioni ricchi di lipidi e del coro ricco di chitina, la loro utilità è limitata dalla difficoltà di montare embrioni su superfici di vetro. In questo lavoro, introduciamo un metodo pratico che migliora significativamente l'attaccamento dell'embrione di Drosophila ai vetrini e dettaglia i nostri metodi per il successo dell'istochimica, dell'immunoistochimica e dell'ibridazione in situ.Prima dei passaggi mostrati qui, le diapositive devono essere lavate con detergente, quindi risciacquate in acqua di rubinetto e acqua distillata prima di essere poste in forno ad asciugare. I vetrini asciutti devono essere delicatamente immersi in dicromato di potassio per 24 ore prima di essere risciacquati e asciugati di nuovo, quindi posti in etanolo al 95% per almeno due ore. Durante questo passaggio, è possibile preparare ulteriori diapositive o la gelatina di allume al cromo secondo i nostri metodi.La gelatina può quindi essere conservata in acqua a bagno a 60 gradi prima dell'uso. Per rivestire le diapositive, far cadere una piccola quantità di gelatina su un bordo del vetrino. Quindi utilizzare un altro vetrino per trascinare lentamente e uniformemente la gelatina sulla superficie del vetrino da rivestire.Questo crea uno strato sottile e uniforme. Prima di essere messo in una cremagliera o in un apparecchio di essiccazione da conservare in un forno per consentire l'asciugatura completa per un'altra notte o 48 ore. Gli embrioni vengono raccolti utilizzando un piatto di agar di succo d'uva, una volta pronto, il piatto di agar di succo d'uva può quindi essere rimosso.Inondare la piastra con PBS e spazzolare delicatamente con una spazzola morbida per rimuovere eventuali embrioni attaccati. Rimuovere l'embrione contenente PBS in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e lasciarlo riposare sul ghiaccio. Una volta che l'embrione è stato depositato sul ghiaccio, rimuovere delicatamente il PBS surnatante.Fare attenzione a non disturbare l'embrione nella parte inferiore del tubo. Aggiungere 1 mL di candeggina al 50% al campione e agitare delicatamente per due minuti. Rimuovere la candeggina mediante filtrazione e lavare gli embrioni in PBS tre volte.Preparare n-eptano. Una volta pronti, lavare gli embrioni dalla carta da filtro in n-eptano agitando delicatamente la carta da filtro nella soluzione. Lasciare che gli embrioni si depositino sul fondo della piastra n-eptano e raccogliere questo n-eptano in un nuovo tubo centrifugo da 1,5 millilitri.Aggiungere un millilitro di metanolo al tubo, lasciare precipitare la soluzione e quindi aspirare il metanolo n-eptano. Lavare l'embrione in PBS da tre a cinque volte per rimuovere il metanolo residuo. Rimuovi questo PBS extra e aggiungi il fissativo di Bouin e lascia riposare da 30 a 60 minuti per fissare gli embrioni.Rimuovere il fissativo di Bouin e lavare nuovamente gli embrioni in PBS tre volte. Preparare l'1,2% di agarosio in PBS e tenere al caldo a bagnomaria a 60 gradi, quindi preparare gli embrioni per l'incorporamento aspirando delicatamente PBS extra in cui è stato conservato. Fare attenzione a non disturbare gli embrioni sul fondo, quindi aspirare il tappo dell'embrione sul fondo della soluzione e posizionarlo delicatamente in uno stampo per tappo di bottiglia.Aspirare qualsiasi PBS aggiuntivo da questo stampo prima di aggiungere l'1,2% di gel di agarosio. Preparare una soluzione di PBS per conservare questi tappi di agarosio. Una volta che l'agarosio si è solidificato, le singole spine possono essere spostate in questo PBS per l'archiviazione.Qui mostriamo il processo di disidratazione sequenziale. Lasciando 15 minuti per l'incubazione ogni volta. Quindi rimuovere dall'etanolo al 100% e fissare in una soluzione one-to-one di etanolo e xilene per altri 15 minuti.Una volta rimosso da questa soluzione one-to-one, rimuovere in xilene puro per un minuto. Ora il campione di tessuto è pronto per essere spostato in una soluzione di paraffina di xilene uno a uno riscaldata. Lasciare riposare per 30 minuti prima dell'incorporazione finale in paraffina al 100%.Passare al primo di 100% paraffina e riposare per due ore. Ripeti questo processo nelle sue due e tre paraffine. Il campione è ora pronto per essere spostato in uno stampo e lo stampo riempito di cera per completare il processo di incorporamento.Incorporamento di embrioni di Drosophila. Mettere le sezioni di paraffina preparate di embrioni di Drosophila in un forno a 60 gradi per 15 minuti. Metterli in una soluzione al 100% di xilene.Iniziamo quindi la reidratazione. Posizionare le diapositive in ciascuna di queste soluzioni per tre minuti ciascuna. Una volta che il vetrino è in acqua distillata, mettere nella soluzione di ematossilina per due minuti.Una volta completato assicurarsi di drenare il più possibile la soluzione dal vetrino. Una volta che il vetrino è stato lavato in acqua distillata, quindi macchiare il vetrino in eosina per un minuto. Infine, rimuovere il vetrino dall'eosina e lavare in acqua distillata.Una volta che questa diapositiva è pulita, iniziamo il nostro processo di disidratazione finale. Infine essere messo in 100% xilene per cinque minuti. Questo processo viene ripetuto in due nuove soluzioni di xilene al 100% e lascia cadere una piccola quantità di gomma neutra lungo un bordo della diapositiva.Prendere questo coperchio scivolare e posizionare delicatamente su un bordo della diapositiva. Per prima cosa deparaffinizzare le diapositive inserendole in 100% xilene. Una volta rimossi i vetrini dall'acqua distillata, devono essere coperti con una soluzione acida periodica all'1%.Quindi scartiamo la soluzione in eccesso e risciacquiamo in acqua distillata. Posizionando il vetrino direttamente in una soluzione preriscaldata. Una volta completato, risciacquiamo il vetrino in acqua distillata e quindi tingiamo la soluzione con cloruro d'oro allo 0,2% per uno o due minuti.Successivamente, fissiamo il tessuto con il 3% di tiosolfato di sodio per tre minuti usando acqua distillata. E poi contromacchia con ematossilina. Dopo la controcolorazione, la macchia può essere lavata con entrambi i tubi di acqua distillata come mostrato qui.Quindi passiamo al processo di disidratazione. Segui questo mettendo le diapositive direttamente in 100% xilene e quindi applica una piccola quantità di gomma neutra nell'angolo della diapositiva. Coprire delicatamente con un coperchio.Iniziare a preparare i vetrini come in precedenza deparaffinizzando e xilene. E poi in etanolo xilene uno-a-uno. Una volta che i vetrini sono deparaffinati, iniziamo a reidratare il loro tessuto e infine in PBS.Posizionare i vetrini in perossido di idrogeno allo 0,3% in metanolo per 10 minuti. Quindi le diapositive sono coperte con 20 ml di soluzione di recupero del bersaglio. Le diapositive possono quindi essere posizionate nella scatola di colorazione.Posizionare la cassetta delle scale in un piroscafo, assicurandosi che nessuna soluzione sfugga e che le diapositive siano ancora completamente coperte. Si noti che il coperchio della scatola delle macchie non deve essere completamente chiuso in modo che il vapore acqueo possa fuoriuscire durante il processo di cottura a vapore. E poi risciacquare delicatamente in PBS-T tre volte.Scartare la soluzione in eccesso e ripetere il processo, questa volta con PBS. Successivamente, incubamo i vetrini in un blocco di perossido per cinque-10 minuti e poi risciacquiamo più volte in PBS-T e poi in PBS. Preparare l'anticorpo e cadere direttamente sul tessuto.Questi tessuti possono quindi essere incubati o a temperatura ambiente per quattro ore. L'anticorpo secondario deve essere incubato a temperatura ambiente per 90 minuti, che è la colorazione con 5% DAB per due a 10 minuti. Dopo aver ottenuto il colore appropriato, risciacquare in acqua distillata e quindi contromacchiare in ematossilina.Dopo questa macchia di ematossilina, i vetrini possono quindi essere disidratati sequenzialmente. Posizionare i vetrini in 100% xilene e lasciare in ammollo per tre minuti. Quindi far cadere piccole quantità di gomma neutra su un bordo della diapositiva.Una volta posizionata una gomma, prendere il coperchio del vetrino e posizionarlo delicatamente da un bordo del vetrino. Aggiungere un microgrammo di DNA modello linearizzato purificato a un flaconcino di reazione sterile privo di RNasi. Quindi aggiungere abbastanza acqua doppia distillata sterile trattata dePC senza RNasi per ottenere un volume totale del campione di 13 microlitri.Quindi centrifugare brevemente e incubare per due ore a 37 gradi Celsius. Per gli esperimenti di protezione della RNasi, si consiglia l'incubazione per 15 minuti con due microlitri di Dnase-1, RNasi-free per rimuovere il DNA modello. Una volta completata la fase di incubazione, interrompere la reazione aggiungendo due microlitri di 0,2 EDTA molare a pH di otto.Prima dei passaggi mostrati qui le diapositive sono state deparaffinate e reidratate, secondo il nostro protocollo precedentemente dimostrato. Dopo la reidratazione incubare i vetrini in 0,01 moli per litro PBS a pH di 7,4 per cinque minuti ciascuno per rimuovere la soluzione fissativa dal tessuto. Dopo il risciacquo in PBS, risciacquiamo con una soluzione di glicina da 100 millimolari per litro per cinque minuti due volte per rimuovere i gruppi di aldeide liberi dal tessuto.Dopo questo passaggio, risciacquare i vetrini con PBS per cinque minuti. Quindi, incubare in PBS contenente 0,3% tritone X-100 per 15 minuti prima del risciacquo e quindi incubare di nuovo con un microgrammo per microlitro di proteinasi K.Successivamente, fissare i vetrini con paraformaldeide al 4% e PBS a pH di 7,2 per tre minuti. Quindi, lavare i vetrini prima di incubare con 0,1 tampone molare trietanolammina pH 8, contenente 0,25% anidride acetica.È possibile scegliere di inclinare la scatola in questa fase per garantire una copertura completa con la soluzione. La scatola viene preparata aggiungendo il 20% di glicerolo o acqua DEPC sul fondo di una scatola di ibridazione a secco. Quindi, coprire le diapositive in 20 microlitri di soluzione di pre ibridazione.DNA dello sperma del salmone ad una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro per ogni vetrino. E poi incubare a 42 gradi Celsius per quattro ore. Questo viene fatto in una scatola umidificata pre-preparata per garantire che la soluzione non si asciughi durante questo processo.Nella fase post-ibridazione, è molto importante che la soluzione di ibridazione sia completamente risciacquata dai campioni. Questo può essere fatto in risciacqui consecutivi di 15 minuti a 37 gradi, utilizzando quattro volte la concentrazione SSC, due volte la concentrazione una volta la concentrazione, 0,5 volte la concentrazione e 0,1 volte la concentrazione SSC. Ogni incubazione per 15 minuti a 37 gradi Celsius.Dopo aver fatto questo, lavare con PBS tre volte per cinque minuti ciascuno prima di aggiungere il tampone di lavaggio. Il tampone di lavaggio deve essere risciacquato per un minuto prima dei passaggi successivi Assicurarsi che il tampone di lavaggio sia completamente asciutto dalle diapositive prima di aggiungere la soluzione successiva. Aggiungere 100 millilitri di soluzione bloccante a ciascun vetrino e incubare il vetrino per 30 minuti.Questo è meglio farlo in un ambiente privo di luce per garantire una buona colorazione. Quindi incubare i vetrini per 30 minuti di nuovo in 20 ml di soluzione anticorpale. Applicare la soluzione anticorpale direttamente sui vetrini per una copertura completa del tessuto.Una volta completata l'incubazione, applicare 100 millilitri di tampone di lavaggio. Incubare per 15 minuti in condizioni di luce libera per rimuovere i coniugati anticorpali non legati. Rimuovere il tampone di lavaggio.Quindi, applicare 20 millilitri di tampone di rilevamento e lasciare incubare per circa quattro minuti. Dopo quattro minuti, rimuovere il buffer di rilevamento. Asciugare i vetrini per evitare soluzioni aggiuntive e aggiungere 10 millilitri di soluzione di substrato colorato appena preparata.Questa reazione inizia entro pochi minuti, ma è completa dopo 16 ore. Quindi lascia incubare per quel periodo di tempo in una condizione di luce libera. Una volta individuati i punti desiderati in cui vengono rilevate le bande, lavare il vetrino con 50 millilitri di tampone TE per fermare la reazione.E poi completare il nostro processo di disidratazione precedentemente mostrato e il processo di montaggio per la gomma neutra. Le figure uno e due dimostrano il metodo di rivestimento della gelatina di alluminio cromato per le sezioni di paraffina e il metodo di incorporamento per il profilo di espressione di FKBP12 e DmFKBP12 nello sviluppo di embrioni di Drosophila. La figura tre mostra la distribuzione proteica degli anticorpi rilevati FKBP12 negli stadi del blastoderma cellulare sinciziale.Da questi risultati istochimici, si può vedere che l'espressione di FKBP12 è meno polarizzata nel blastoderma sinciziale, quindi inizia a localizzarsi all'interno della membrana basale sotto l'epitelio del trofoectoderma informa il gradiente con più espressione trovata nei poli anteriore e posteriore. La figura quattro, che segue le fasi iniziali e tardive della relazione gassosa dell'embrione di Drosophila, mostra che la proteina FKBP12 si limita a determinati componenti architettonici del tessuto embrionale primitivo. Con una distribuzione extracellulare inferiore a quella osservata nelle fasi embrionali gastro embrionali precoci e tardive.È interessante notare che la distribuzione dinamica delle proteine sopra descritta non è accompagnata da corrispondenti cambiamenti nei livelli mrI di FKBP12 come visto nella figura cinque. Indicare che l'espressione proteica è il risultato di un meccanismo molecolare post-trascrizionale ancora sconosciuto. La segnalazione del calcio mediata dal recettore della rianodina è una via fondamentale in molti processi fisiologici e patologici di animali vertebrati e invertebrati.Le mutazioni in questo gene sono note per causare molti disturbi fisiologici che portano a malattie o morte cardiaca precoce. Tuttavia, il ruolo che questo gene svolge nello sviluppo precoce di Drosophila è stato difficile da studiare. Come componente di transito dell'embrione, l'embrione ricco di lipidi e il corion ricco di chitina, rendono difficili gli studi sull'espressione proteica ed embrionale nello sviluppo precoce della Drosophila.Il rivestimento del vetrino, l'incorporamento dell'embrione e le tecniche immunoistochimiche descritte in questo articolo ci hanno permesso di studiare in dettaglio la distribuzione dinamica della proteina del recettore della rianodina e dell'mRNA. Condividiamo queste tecniche e la speranza che permetteranno ad altri di studiare altre proteine durante le prime fasi di sviluppo della Drosophila.

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