Name: Editing genetico delle cellule B del macaco rhesus primario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Impara l'editing genetico delle cellule B primarie del macaco rhesus con CRISPR/Cas9 e rAAV6 per la ricerca preclinica sulle terapie cellulari B. Questo metodo efficiente supporta lo sviluppo di trattamenti immunoterapici.

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Vorremmo ringraziare Harry B. Gristick e Pamela Bjorkman per aver fornito l'antigene RC1 e tutti i laboratori Nussenzweig e Martin per una discussione critica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della Fondazione Bill e Melinda Gates INV-002777 (a MCN) e dal Programma di ricerca intramurale del National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. (R.G. e M.A.M). M.C.N. è un investigatore HHMI.

<ol><li>Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal centers.</a> Annual Review of Immunology. 40, 413-442 (2022).</li>
<li>Plotkin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+protection+induced+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Correlates of protection induced by vaccination.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).</li>
<li>Brinkmann, V., Heusser, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+differentiation+of+human+B+cells+into+IgM%2C+IgG%2C+IgA%2C+or+IgE+plasma+cells%3A+High+rate+of+antibody+production+by+IgE+plasma+cells%2C+but+limited+clonal+expansion+of+IgE+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors.</a> Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).</li>
<li>Chernecky, C. C., Berger, B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChernecky%2C+CC+%22Protein+Electrophoresis+-+Serum.%2C+6th+edition%22">Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition</a>. , Elsevier Saunders. St Louis, MO. 917-920 (2013).</li>
<li>Balazs, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+protection+against+HIV+infection+by+vectored+immunoprophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis.</a> Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).</li>
<li>Greiner, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+editing+of+the+B+cell+receptor+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells.</a> iScience. 12, 369-378 (2019).</li>
<li>Hartweger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+humoral+immune+responses+by+CRISPR%2FCas9-edited+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+elicitation+of+HIV+broadly+neutralizing+antibodies+from+engineered+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells.</a> Nature Communications. 11, 5850(2020).</li>
<li>Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+strategies+to+actualize+B+cell-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies.</a> Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineered+B+cells+secrete+high+titers+of+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+B+cells+expressing+an+anti-HIV+antibody+enable+memory+retention%2C+isotype+switching+and+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion.</a> Nature Communications. 11, 5851(2020).</li>
<li>Voss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+antigen+specificity+of+B+cells+using+genome-editing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies.</a> eLife. 8, 42995(2019).</li>
<li>Pesch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+design%2C+optimization%2C+and+genomic+integration+of+chimeric+B+cell+receptors+in+murine+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2630(2019).</li>
<li>Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+of+mouse+and+human+immunoglobulin+genes+by+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 7, 10934(2016).</li>
<li>Rogers, G. L., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+edited+B+cells%3A+A+new+frontier+in+immune+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144(2018).</li>
<li>Wu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+primary+human+B+cells+with+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).</li>
<li>Luo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+alpha-PD-1+antibody-expressing+long-lived+plasma+cells+by+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+gene+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration.</a> Cell Death and Disease. 11 (11), 973(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+of+primary+human+B+cells+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61855(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering+of+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).</li>
<li>Moffett, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+engineered+to+express+pathogen-specific+antibodies+protect+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li>
<li>Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+comes+a-knock-in+to+reprogram+antibodies+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).</li>
<li>Nishimura, Y., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+macaques%2C+and+men%3A+Broadly+neutralizing+antibody+immunotherapy+for+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1.</a> Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).</li>
<li>Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monkeying+around+with+HIV+vaccines%3A+Using+rhesus+macaques+to+define+%27gatekeepers%27+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).</li>
<li>Kreuser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+methods+for+generation+and+expansion+of%2C+and+gene+delivery+to+rhesus+macaque+plasma+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Gujer, C., Sundling, C., Seder, R. A., Karlsson Hedestam, G. B., Lore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rhesus+plasmacytoid+dendritic+cell+and+B-cell+responses+to+Toll-like+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human and rhesus plasmacytoid dendritic cell and B-cell responses to Toll-like receptor stimulation.</a> Immunology. 134 (3), 257-269 (2011).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+enrichment-free+massive+ex-vivo+expansion+of+peripheral+CD20%28%2B%29+B+cells+via+CD40-CD40L+signals+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell enrichment-free massive ex-vivo expansion of peripheral CD20(+) B cells via CD40-CD40L signals in non-human primates.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 473 (1), 92-98 (2016).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-attenuating+adenovirus+enables+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+for+high+manufacturing+yield+without+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination.</a> Nature Communications. 13, 1182(2022).</li>
<li>Endo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+clinical+outcomes+in+rhesus+monkeys+inoculated+with+a+highly+pathogenic+chimeric+simian%2Fhuman+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).</li>
<li>Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+splenectomy+in+the+era+of+minimally+invasive+surgery%3A+The+current+laparoscopic+and+robotic+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences.</a> Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+cesium+chloride-+and+iodixanol-based+purification+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+preclinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simplified+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus.</a> Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12, 686(2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+neutralizing+macaque+monoclonal+antibody+against+the+HIV-1+V3-Glycan+patch%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch.</a> eLife. 9, 61991(2020).</li>
<li>Escolano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+expands+B+cells+specific+to+HIV-1+V3+glycan+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques.</a> Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).</li>
<li>Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukapheresis+protocol+for+nonhuman+primates+weighing+less+than+10+kg%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).</li>
<li>Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+increases+efficiency+of+genome+editing+at+two+non-coding+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci.</a> PLoS One. 13 (6), 0198637(2018).</li>
</ol>

Non vengono dichiarati interessi concorrenti.

I protocolli qui presentati forniscono un metodo rapido ed efficiente per generare alti rendimenti e titoli di rAAV6 come HDRT e nuovi metodi per modificare in modo efficiente le cellule B del macaco rhesus primario in vitro.
Il protocollo di produzione rAAV6 è relativamente semplice e veloce, consentendo la produzione e il collaudo di molti costrutti diversi contemporaneamente senza lavoro eccessivo. Se lo si desidera, rAAV6 può essere ulteriormente purificato utilizzando protocolli consolidati come l'ultracentrifugazione a gradiente di iodixanolo34 o il partizionamento acquoso a due fasi35 prima dello scambio tampone e della concentrazione.
Sebbene abbia ridotto la resa complessiva, abbiamo optato per utilizzare solo il terreno di coltura cellulare ridotto dal siero per la purificazione di rAAV6 invece della purificazione dal pellet cellulare, poiché la maggior parte di rAAV6 viene rilasciata nel mezzo36 e la purificazione dal pellet cellulare aggiunge più costi e manodopera. L'uso dell'helper adenovirale autoinattivante ha aumentato le rese in media di 30-40 volte, consentendo di testare costrutti confezionati in AAV6 in un unico piatto da 15 cm. Sebbene il nostro metodo di purificazione sia di base, utilizzando questo metodo, otteniamo relativamente poca variazione da lotto a lotto nell'efficienza di editing genico o nella vitalità cellulare dopo la trasduzione utilizzando varie linee cellulari o altre cellule primarie (dati non mostrati).
Abbiamo sviluppato un protocollo di purificazione delle cellule B del macaco rhesus per ottenere cellule B primarie intatte utilizzando l'esaurimento negativo delle popolazioni indesiderate. Sebbene non sia necessario per l'editing genetico di queste cellule, fornisce un modo per ottenere una popolazione relativamente pura di cellule B primarie di macaco rhesus per questa o altre applicazioni nel caso in cui altri tipi di cellule interferiscano con gli obiettivi sperimentali. Tuttavia, la purezza arriva al costo di una riduzione delle rese complessive delle cellule B. In particolare, sia per le colture di cellule B arricchite che non arricchite, la frazione di cellule B nelle preparazioni iniziali di PBMC o splenociti è cruciale. Per le PBMC in particolare, raccomandiamo lo screening di diversi macachi per individui con un'alta percentuale di cellule B nel sangue periferico per ottenere un numero elevato di cellule B per gli esperimenti, poiché questo valore può differire notevolmente tra gli individui27. Le PBMC possono essere ottenute mediante sanguinamento regolare o leucaferesi42.
Il protocollo di editing genetico porta a un editing genetico efficiente, in genere tra il 60% -80% delle cellule knock-out e il 5% -20% delle cellule B knock-in, sebbene abbiamo raggiunto fino al 90% di knock-out BCR e il 40% di cellule B knock-in BCR (Figura 5 e Figura 6).
I parametri principali per l'editing efficiente delle cellule B del macaco rhesus sono l'efficienza di taglio dell'sgRNA, i parametri di elettroporazione, il MOI e la qualità della preparazione di rAAV6. Le efficienze di taglio degli sgRNA candidati dovrebbero essere determinate empiricamente per consentire l'editing e la progettazione ottimali dell'HDRT. I parametri di elettroporazione qui presentati bilanciano l'efficienza con la fattibilità per ottenere il numero totale massimo di cellule B modificate piuttosto che la più alta percentuale di cellule B modificate. Se è necessaria una percentuale maggiore di celle modificate, si raccomanda un aumento delle tensioni (fino a 1.750 V) o lunghezze di impulso alterate (10-30 ms), sebbene si possa osservare una maggiore morte cellulare. Abbiamo anche notato efficienze di editing leggermente superiori nelle cellule B spleniche rispetto alle cellule B delle PBMC dello stesso individuo (Figura 5); Tuttavia, la ragione di fondo di ciò è attualmente sconosciuta.
Abbiamo scoperto che l'aggiunta dell'1% di DMSO dopo l'elettroporazione ha aumentato significativamente l'efficienza di editing genico di ~ 40% nelle cellule B del macaco rhesus senza influenzare la vitalità cellulare (Figura 6A-C), in linea con i rapporti in altre cellule43. Tuttavia, la coltura estesa in DMSO all'1% deve essere evitata e può influire sulla vitalità cellulare. DMSO può essere completamente omesso se lo si desidera.
La coltura delle cellule in un piccolo volume dopo l'elettroporazione per diverse ore insieme a rAAV6 porta a maggiori efficienze di editing, probabilmente a causa della migliore trasduzione dell'HDRT da parte dell'rAAV6 e, quindi, della maggiore concentrazione intracellulare di HDRT nel momento in cui Cas9 è attivo. Abbiamo scoperto che coltivare le cellule in questo modo per un massimo di 8 ore non ha influenzato la vitalità cellulare, ma l'efficienza di editing non è aumentata drasticamente oltre le 5 ore (Figura 6). Se è necessario solo foratura anziché knock-in, questo passaggio può essere omesso.
In conclusione, presentiamo protocolli completi per l'editing genetico delle cellule B del macaco rhesus in vitro e la produzione di rAAV6 HDRT necessari per l'efficiente knock-in dei costrutti desiderati. Questi protocolli consentono la sperimentazione rapida ed economica di molti costrutti confezionati come rAAV6 e consentono la sperimentazione preclinica della fattibilità e della scalabilità delle terapie con cellule B in un modello di primate non umano più rilevante.

Le cellule B sono il fondamento dell'immunità umorale. Dopo l'attivazione da parte dell'antigene affine e dei segnali secondari, le cellule B naïve danno origine alle cellule B del centro germinale, alle cellule B di memoria e alle plasmacellule1. Quest'ultimo è la fonte degli anticorpi secreti che mediano le funzioni protettive della maggior parte dei vaccini attualmente disponibili2. Le plasmacellule sono state descritte come fabbriche di anticorpi in quanto secernono grandi quantità di anticorpi nel siero, circa 2 ng / giorno / cellula3, pari a 7-16 g / L siero, rendendo gli anticorpi una delle tre proteine più abbondanti nel siero4. Le cellule B sono abbondanti nel sangue e possono, quindi, essere facilmente ottenute e reinfuse in un individuo.
Questi tratti hanno reso le cellule B un bersaglio degli sforzi della terapia cellulare per modificare geneticamente il recettore delle cellule B (BCR) ed esprimere anticorpi ampiamente neutralizzanti (bNAbs) al virus dell'immunodeficienza umana (HIV)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e altre proteine 16, 17,18,19,20,21. Tali approcci hanno mostrato il potenziale in numerosi studi sui topi in vivo 7,8,10,11,16,22. Tuttavia, diversi ostacoli devono ancora essere superati per la traduzione clinica 9,15,23, tra cui la sicurezza, la durata e l'entità dell'efficacia terapeutica, nonché il ridimensionamento ad animali più grandi come i primati non umani (NHP). Infatti, gli NHP, e in particolare i macachi rhesus, che hanno una lunga storia nella ricerca sugli anticorpi e sull'HIV24,25, sono il modello più adatto per testare questi parametri.
Qui, abbiamo sviluppato protocolli che consentono di affrontare questi problemi. Ad oggi, pochi studi hanno tentato di coltivare cellule B di macaco rhesus ex vivo, e solo una selezione positiva utilizzando CD20 è stata riportata per la purificazione delle cellule B del macaco rhesus26,27,28. Abbiamo stabilito un protocollo per l'isolamento delle cellule B del macaco rhesus intatte mediante deplezione negativa di altri tipi di cellule. Inoltre, sono definite condizioni di coltura per l'editing genetico mirato delle cellule B del macaco rhesus. Questo protocollo delinea l'uso delle ribonucleoproteine (RNP) CRISPR / Cas9 e del sierotipo 6 del virus adeno-associato ricombinante (rAAV6) come modello di riparazione diretto dall'omologia (HDRT) per modificare le cellule B del macaco rhesus in coltura di genetica. Utilizzando questo protocollo, sono state raggiunte efficienze di editing fino al 40% con inserti di grandi dimensioni (~ 1,5 kb). Presentiamo anche un metodo rapido ed economico per produrre rAAV6 utilizzando un helper adenovirale29 abilitato alla tetraciclina e autosilenziante per consentire il test rapido degli HDRT in questo formato. Combinati, questi protocolli descrivono un flusso di lavoro efficiente per l'editing genetico delle cellule B del macaco rhesus (Figura 1), consentendo la valutazione delle terapie con cellule B in un modello NHP.
Per iniziare gli esperimenti, il materiale donatore può essere ordinato da fonti commerciali o ottenuto mediante flebotomie o splenectomia. In questo studio, le flebotomie e le raccolte di sangue sono state eseguite come descritto in precedenza30 utilizzando l'anticoagulante EDTA. Per ottenere cellule B di macaco rhesus primitivo splenico, sono state eseguite splenectomie parziali (25% -50%) o totali utilizzando tecniche riportate in precedenza31. Gli animali sono stati sottoposti a digiuno durante la notte prima dell'intervento. In breve, durante l'intervento, l'addome è stato tagliato e preparato con scrub alternati di clorexidina e alcool isopropilico al 70% tre volte. Un'incisione (5-10 cm) è stata fatta nell'addome per identificare e isolare la milza. La vascolarizzazione della milza era legata con punti di sutura o morsetti vascolari. L'incisione è stata chiusa in due strati con suture di polidiossanone 4-0 PDS. La splenectomia è stata eseguita una sola volta per un singolo animale. Le sospensioni monocellulari sono state preparate dalla milza del macaco mediante macerazione attraverso filtri cellulari. Le cellule mononucleate del sangue e delle sospensioni di cellule spleniche sono state preparate utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità e conservate in azoto liquido.

<table><tbody><tr><td>Provetta da 1,5 mL sterile, priva di Dnase, Rnasi e purogeni</td><td>Stellar Scientific</td><td>T17-125</td><td>o similare</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 10 mL, polistirene, sterile, apirogena, priva di DNasi/RNasi e priva di DNA umano</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale da 15 cm</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>o simile</td></tr><tr><td>15 mL di polipropilene conico</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>o similare</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 25 mL, polistirene, sterile, apirogena, priva di DNasi/RNasi e priva di DNA umano</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>o simile</td></tr><tr><td>250 mL di polipropilene conico tipo</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Linea cellulare 293AAV</td><td>Cell Biolabs</td><td>AAV-100</td><td></td></tr><tr><td>2-B-mercapto-etanolo, 55mM (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Coltura tissutale a 48 pozzetti piastra</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>o similare</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 5 mL, polistirene, sterile, apirogena, priva di DNasi/RNasi e priva di DNA umano</td><td>Corning</td><td>4487</td><td>o</td></tr><tr><td>simili Siringhe da 5 mL con punta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td>o simili</td></tr><tr><td>50 mL di polipropilene conico</td><td>tybe Falcon</td><td>352070</td><td>o similare</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 50 mL, polistirene, sterile, apirogena, priva di DNasi/RNasi e DNA umano</td><td>Corning</td><td>4490</td><td>o piastra per</td></tr><tr><td>coltura tissutale a 6 pozzetti</td> simile Sistema di confezionamento <td>Falcon</td><td>353046</td><td>o simile</td></tr><tr><td>AAV-6 (plasmidi)</td>Materiali di riferimento <td>Cell Biolabs</td><td>VPK-406</td><td></td></tr><tr><td>AAV6 (capsidi completi)</td><td>Charles River</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet S Controller per pipette</td><td>Marca</td><td>26350</td><td>o simile controller per pipette</td></tr><tr><td>Antibiotico/Antimicotico 100x</td><td>Gibco</td><td>15260-062</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD14 AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>301812</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD14 biotina</td><td>BioLegend</td><td>301826</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano CD16 AlexaFluor700</td><td>BD Biosciences</td><td>557920</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD16 anti-umana</td><td>BioLegend</td><td>302004</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD20 anti-umana BioLegend</td><td></td><td>Biolegend 302312</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD3 anti-umana</td><td>Thermo Fisher</td><td>APS0309</td><td></td></tr><tr><td>anti-umana CD3 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552127</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD33 anti-umana</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-347</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD64 anti-umana</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>305004</tr><tr><td>biotina CD66 anti-umana</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-143</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD89 anti-umana</td><td>BioLegend</td><td>354112</td><td></td></tr><tr><td>biotina CD8a anti-umana</td><td>BioLegend</td><td>301004</td><td></td></tr><tr><td>anti-umana HLA-DR BV605</td><td>Biolegend</td><td>307640</td><td></td></tr><tr><td>catena leggera Ig anti-umana lambda APC</td><td>316610</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-umano IgM BV421</td><td>Biolegend</td><td>314516</td><td></td></tr><tr><td>anti-umano Kappa Light Chain FITC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab 250</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Incubatore a CO2 per colture cellulari</td><td>Fisher Scientific</td><td>51026331</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Unità di filtro centrifugo (Amicon Ultra - 4, 100 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>o qualsiasi altra centrifuga a secchiello oscillante raffreddabile con inserti per piastre a 96 pozzetti, provette da 15, 50 e 250 mL</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher</td><td>Scientific C298SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Cpg ODN</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-2395</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (senza RNasi)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Kit di elettroporazione (Neon Transfection System 10 &micro; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td>o altre dimensioni o kit di trasfezione da 100 uL MPK 10096</td></tr><tr><td>Sistema di elettroporazione (Neon Transfection System)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03*</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS)</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Cappa</td><td>aspirante Fisher Scientific</td><td>FH3943810244</td><td>o similare</td></tr><tr><td>Glutammina 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro Graduato 1L</td><td>Corning</td><td>3022-1L</td><td>o</td></tr><tr><td>similare Emocitometro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z375357-1EA</td><td>o similare</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore Magnetico con Piastra Riscaldante</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857200</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Human BAFF</td><td>Peprotech</td><td>310-13</td><td></td></tr><tr><td>Umano BD Fc Blocco</td><td>BD</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Umano IL-10</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 Umano</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per siringhe idrofili in polietersulfone, (membrana Supor), sterili - 0,2 e micro; m, 25 mm&nbsp;</td><td>Pall</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferina-Selenio, 100x</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Primer ITR in avanti: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>primer ITR personalizzato</td><td></td></tr><tr><td>reverse: CGGCCTCAGTGAGCGA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>personalizzato</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di biosicurezza a flusso laminare</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Colonna a grande deplezione magnetica (LD)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Separatore Magentico (separatore MidiMACS e multistand)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-329</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-127</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Perle magnetiche di streptavidina (Microsfere di streptavidina)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Kit Maxiprep</td><td>Machery-Nagel</td><td>740414.5</td><td>o simili</td></tr><tr><td>Flaconi per terreni 2L con tappo</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34514-26</td><td>o simile</td></tr><tr><td>MegaCD40L</td><td>Enzo</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Piastra di reazione ottica a 384 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola adesiva ottica MicroAmp</td><td>Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td>o qualsiasi altra centrifuga da tavolo per provette da 1,5 mL</td></tr><tr><td>Forno a microonde</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD987SA</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Nikon TMS Microscopio a contrasto di fase invertito Nikon</td><td></td><td>TMS</td><td>o qualsiasi altro microscopio a contrasto di fase invertito per colture cellulari</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Tampone duplex senza nucleasi</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi</td> Misuratore <td>di pH 129115</td><td></td><td>Qiagen</td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2, P20, P200, P1000 e puntali</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>o simile Set di pipette e puntali</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 10 %</td><td>Gibco</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina, lineare, MW 25000, grado di trasfezione (PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-100</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia di precisione</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME4001TE</td><td>o</td></tr><tr><td>simili Filtri di pre-separazione (30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere in vetro Pyrex 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34502-13</td><td>o</td></tr><tr><td>simile Bicchiere in vetro Pyrex 250 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS1000250</td><td>o simile</td></tr><tr><td>qPCR Instrument</td><td>Fisher Scientific</td><td>4485691</td><td>o antigene</td></tr><tr><td>RC1 simile biotinilato casualmente</td><td>Bjorkman lab, CalTech</td><td>in house</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>S.p. Cas9 Nucleasi</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>Scientific 1203 Bagno d'acqua</td><td>VWR</td><td>24118</td><td>o qualsiasi bagno d'acqua impostato su &nbsp; 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti monouso sterili con membrane PES</td><td>Thermo&nbsp; Scientifico Nalgene</td><td>567-0020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Vettore adenovirale autosilenziante abilitato per tetraciclina RepCap6&nbsp;</td><td>Oxgene</td><td>TESSA-RepCap6</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Tripano Blu, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di purificazione dell'acqua</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZEQ7000TR</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Zombie-NIR</td><td>Biolegend</td><td>423106</td><td></td></tr></tbody></table>

editing genetico delle cellule b del macaco rhesus primario

Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells

Le cellule B e la loro progenie sono le fonti di anticorpi altamente espressi. Le loro elevate capacità di espressione proteica insieme alla loro abbondanza, alla facile accessibilità tramite sangue periferico e alla possibilità di semplici trasferimenti adottivi li hanno resi un bersaglio attraente per gli approcci di editing genico per esprimere anticorpi ricombinanti o altre proteine terapeutiche. L'editing genetico delle cellule B primarie di topo e umane è efficiente e i modelli murini per gli studi in vivo hanno mostrato risultati promettenti, ma la fattibilità e la scalabilità per modelli animali più grandi non sono state finora dimostrate. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo per modificare le cellule B primarie del macaco rhesus in vitro per consentire tali studi. Riportiamo le condizioni per la coltura in vitro e l'editing genetico di cellule B primarie di macaco rhesus da cellule mononucleate del sangue periferico o splenociti utilizzando CRISPR / Cas9. Per ottenere l'integrazione mirata di cassette di grandi dimensioni (<4,5 kb), è stato incluso un protocollo rapido ed efficiente per la preparazione del sierotipo 6 del virus adeno-associato ricombinante come modello di riparazione diretto dall'omologia utilizzando un vettore di supporto adenovirale autosilenziante abilitato alla tetraciclina. Questi protocolli consentono lo studio di terapie prospettiche a cellule B nei macachi rhesus.

Presentiamo un metodo per la coltura e l'editing genetico delle cellule B primarie del macaco rhesus utilizzando CRISPR / Cas9 e il sierotipo 6 del virus adeno-associato ricombinante per lo studio delle terapie con cellule B.

Editing genetico delle cellule B del macaco rhesus primario

B cells and their progeny are the sources of highly expressed antibodies. Their high protein expression capabilities together with their abundance, easy ...

Il metodo è relativamente semplice e consente un efficiente editing genetico delle cellule B del macaco rhesus. Il metodo consente di testare le cellule B geneticamente modificate per scopi terapeutici nei macachi rhesus. È adatto anche per la ricerca preclinica sulla terapia cellulare B.Il metodo generale può essere adattato per altri tipi di cellule. Se la procedura viene seguita correttamente, non ci si dovrebbe aspettare lotte. Tuttavia, poiché l'efficienza di taglio del gRNA e un lotto di buona qualità di modello ricombinante che fornisce AAV6 sono fondamentali.Per iniziare, preriscaldare il terreno di coltura delle cellule B in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Scongelare gli stimolanti delle cellule B sul ghiaccio. Preparare un tubo di dimensioni appropriate contenente un mezzo di scongelamento preriscaldato.Scongelare una o due fiale di splenociti primari di macaco rhesus o PBMC in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Decantare gli splenociti nel tubo preparato contenente un mezzo di scongelamento preriscaldato. Risciacquare i criotubi per raccogliere tutte le cellule.Centrifugare le celle a 200 G per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo di scongelamento per il lavaggio. Ripetere le centrifugazioni tre volte per rimuovere il mezzo di congelamento.Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere le cellule a circa cinque volte 10 alle sei cellule per millilitro in un mezzo di coltura di cellule B. Combinare 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 microlitri di 0,4% di tripano blu e contare le cellule su un emocitometro. Regolare la concentrazione cellulare a tre volte 10 alle sei cellule per millilitro con terreno di coltura di cellule B in base al conteggio delle cellule.Quindi, aggiungere gli stimolanti delle cellule B alle loro concentrazioni finali e mescolare. Trasferire le cellule in un piatto di coltura cellulare e incubarle a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48 ore. Dopo l'assestamento, le cellule dovrebbero formare un monostrato denso e piccoli gruppi di cellule potrebbero essere già visibili.Dopo circa due giorni, le cellule dovrebbero essere sane, irregolari e aver formato gruppi visibilmente più grandi. Dopo aver attivato le cellule B, preparare i reagenti per l'elettroporazione e la trasduzione. Preriscaldare il tampone duplex privo di nucleasi DMSO, il buffer T e il tampone E o E2 dal kit di elettroporazione a temperatura ambiente.Scongelare il modello di riparazione diretto dall'omologia rAAV6, o HDRT, e gli stimolanti delle cellule B sul ghiaccio. Risospendere l'RNA a guida singola Cas9 di CRISPR, o sgRNA, a 100 micromolari nel tampone duplex. Ricostituire per 10 minuti a temperatura ambiente e mescolare vorticando e sfarfallando.Porre lo sgRNA ricostituito su ghiaccio fino all'uso. Per l'elettroporazione da 10 microlitri, preparare 550 microlitri di terreno di coltura cellulare B con stimolanti e 1% DMSO. Aggiungere 50 microlitri di questo mezzo con o senza antibiotici in una piastra di coltura cellulare a 48 pozzetti.Quindi, aggiungere rAAV6 HDRT al mezzo nei pozzi, fino al 20% del volume del pozzo. Preriscaldare il piatto preparato e rimanendo il mezzo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Successivamente, per l'elettroporazione da 10 microlitri, preparare 1,15 microlitri di ribonucleoproteina, o RNP, mescolando 0,4 microlitri di Cas9 61-micromolare con 0,75 microlitri di sgRNA 100-micromolare in tampone duplex.Incubare l'RNP per 15 minuti a temperatura ambiente prima di mescolarlo con le cellule. Dopo l'incubazione, più RNP possono essere combinati se più di un locus deve essere preso di mira contemporaneamente. Quindi, preparare le cellule per l'elettroporazione.Lasciare le celle a temperatura ambiente per evitare shock termici. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule in un recipiente appropriato. Risciacquare il piatto con DPBS per raccogliere il numero massimo di celle.Centrifugare le cellule a 200 g per 10 minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in DPBS a circa due volte 10 alle sei cellule per millilitro, in base al numero di cellule immesse nella coltura. Combinare volumi uguali di sospensione cellulare e 0,4% di blu di tripano e contare utilizzando un emocitometro.Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante, risospendere le cellule nel tampone T preriscaldato a 5,55 volte 10 alle sette cellule per millilitro, in base al conteggio delle cellule. Impostare il sistema di trasfezione accendendo la macchina e impostandola su 1.350 volt, 15 millisecondi e un impulso. Posizionare la stazione della pipetta all'interno del paraluce a flusso laminare.Per ogni set di 10 elettroporazioni, preparare un tubo di trasfezione con tre millilitri di tampone E.Inserire il tubo nella stazione di pipetta. Combinare 1,15 microlitri di RNP con nove microlitri di cellule per elettroporazione. Preparare almeno il 20% in più per evitare bolle e incubare a temperatura ambiente per un minuto prima dell'elettroporazione.Aspirare 10 microlitri di RNP e miscela cellulare nella punta dell'elettroporazione su una pipetta di elettroporazione. Inserire la pipetta caricata nella stazione di pipette e avviare l'elettroporazione. Assicurarsi che le punte siano completamente prive di bolle d'aria per evitare l'arco elettrico.Espellere immediatamente le cellule elettroporate nel piccolo volume di mezzo preriscaldato preparato, con o senza rAAV6, all'interno del pozzetto 48. Aggiungi campioni di controllo senza trasfezione ai pozzetti di coltura. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per quattro-sei ore.Alla fine dell'incubazione, aggiungere 450 microlitri di terreno di coltura di cellule B preriscaldato contenente stimolanti, DMSO e con o senza antibiotici nella piastra. Eseguire l'analisi del DNA genomico dopo 24 ore. Quantificare l'efficienza di editing con la reazione a catena della polimerasi a goccia digitale, o PCR, utilizzando un primer all'esterno del braccio di omologia e un primer all'interno dell'inserto.Eseguire la PCR per amplificare il sito di inserimento e il sequenziamento Sanger per verificare il corretto editing. Per analizzare i livelli proteici, coltivare le cellule per 40-48 ore dopo l'elettroporazione per consentire cambiamenti di espressione proteica ed eseguire un'analisi mediante citometria a flusso. La produzione di rAAV6 utilizzando un helper adenovirale abilitato alla tetraciclina e autosilenziante ha portato alla produzione di quattro volte da 10 a 10 GC per millilitro di terreno di coltura cellulare, superando la produzione utilizzando una tripla trasfezione senza aiutanti da 30 a 40 volte.La purificazione opzionale ha portato all'eliminazione della maggior parte delle cellule CD3 + T e delle cellule mieloidi CD14 + e CD16 +, con purezze dall'80 al 95% di cellule CD20 + B ottenute di routine. L'editing genetico delle cellule B del macaco rhesus primario è mostrato qui. Questo studio ha mantenuto un'elevata vitalità cellulare, eliminando contemporaneamente l'espressione della catena leggera nelle cellule dell'80% B.La maggior parte delle cellule B esprimeva ancora l'isotipo IgM. L'aggiunta di rAAV6 che codifica per l'anticorpo 1485 HDRT ha portato all'editing genico e all'espressione superficiale dell'anticorpo 1485 nel 16-21% delle cellule B, sebbene a un'intensità di fluorescenza inferiore per le catene anticorpali rispetto alle cellule B non modificate. L'aggiunta dell'1% di DMSO e incubazioni estese e concentrate con l'HDRT rAAV6 ha generalmente aumentato l'efficienza di editing.Utilizzando questo metodo, in genere è stata raggiunta un'efficienza di editing da cinque a 20% e fino al 40%, a seconda del singolo macaco rhesus e della qualità del lotto rAAV6 HDRT. Durante l'esecuzione dell'elettroporazione, assicurarsi di avere abbastanza miscela per la trasfezione e non ci siano bolle nella punta. Le cellule possono essere analizzate con qualsiasi metodo desiderato o può essere eseguito un trasferimento autologo nel macaco rhesus del donatore.

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Immunologia e Infezioni

Abbiamo dimostrato l'utilità di citometria a flusso multicolore per informazioni dettagliate caratterizzazione fenotipica e funzionale del totale così come sottoinsiemi memoria di CD4 + e CD8 + T nei macachi rhesus, il modello ideale per l'HIV / AIDS studi vaccino.

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Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

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L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare il primate non umano CD34+ cellule dal midollo osseo innescato, gene-modificare queste cellule con vettori lentivirali e preparare un prodotto per infusione nell'ospite autologo. La lunghezza di protocollo totale è di circa 48 ore.

Preparazione e modificazione genetica di staminali ematopoietiche Nonhuman Primate e cellule progenitrici

Presentato qui è un protocollo per l'efficiente editing genico mediato da ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 nelle cellule dei mammiferi utilizzando l'elettroporazione dei tubi.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Illustreremo un protocollo di 9 giorni per la trasduzione e l'espansione delle cellule mononucleari periferiche del macaco rhesus che produce cellule con un'eccellente co-espressione dei geni di interesse in numero sufficiente per gli studi di infusione dell'efficacia cellulare.

Trasduzione ed espansione delle cellule T primarie in nove giorni con manutenzione del fenotipo della memoria centrale

Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per l'ingegneria del genoma basata su CRISPR / Cas9 delle cellule B umane primarie per knockout genico (KO) e knock-in (KI) per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle cellule B e lo sviluppo di terapie a cellule B.

Ingegneria genomica delle cellule B umane primarie utilizzando CRISPR/Cas9

L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire l'editing CRISPR/Cas9 senza soluzione di continuità del genoma di C. elegans utilizzando complessi di ribonucleoproteine assemblati e il marcatore co-CRISPR dpy-10 per lo screening. Questo protocollo può essere utilizzato per apportare una varietà di modificazioni genetiche in C. elegans tra cui inserzioni, delezioni, sostituzioni geniche e sostituzioni codone.

CRISPR/Cas9 Editing del gene C. elegans rbm-3.2 utilizzando il marcatore di screening dpy-10 Co-CRISPR e complessi di ribonucleoproteine assemblati.

Questo protocollo descrive la procedura per l'editing del genoma nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo utilizzando complessi ribonucleoproteici Cas9-sgRNA assemblati in vitro e somministrati mediante elettroporazione.

Distruzione genica ad alta efficienza nei macrofagi primari derivati dal midollo osseo utilizzando complessi elettroporati Cas9-sgRNA

La somministrazione degli editori genomici come RNA è un mezzo particolarmente potente per modificare i genomi delle cellule e delle linee cellulari primarie dei mammiferi. L'obiettivo di questo protocollo è fornire editori genomici come mRNA nelle cellule e linee cellulari primarie dei mammiferi, seguiti da sequenziamento e analisi mirati di Illumina per quantificare gli esiti di editing.

Editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi tramite elettroporazione dell'RNA editor

Impara l'editing genetico delle cellule B primarie del macaco rhesus con CRISPR/Cas9 e rAAV6 per la ricerca preclinica sulle terapie cellulari B. Questo metodo efficiente supporta lo sviluppo di trattamenti immunoterapici.

Editing genetico delle cellule B del macaco rhesus primario

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