Estrazione di microtubuli modificati da cellule di mammifero per studiare complessi microtubulo-proteine mediante microscopia crioelettronica
3 marzo 2023
Qui, descriviamo un protocollo per estrarre la tubulina endogena da cellule di mammifero, che possono mancare o contenere specifici enzimi modificanti i microtubuli, per ottenere microtubuli arricchiti per una specifica modifica. Descriviamo quindi come i microtubuli estratti possono essere decorati con proteine purificate che legano i microtubuli per preparare griglie per la microscopia crioelettronica.
Gli studi strutturali delle proteine che interagiscono con i microtubuli mediante microscopia crioelettronica sono cruciali per comprendere i meccanismi cellulari. La preparazione di microtubuli omogenei legati a proteine interagenti su una griglia crio-EM è cruciale per il successo. Questo protocollo è semplice, economico e consente di preparare microtubuli con modificazioni post-traduzionali controllate in quantità e qualità sufficienti per la microscopia crioelettronica.
I microtubuli sono molto sensibili alla temperatura. È quindi importante mantenere calde le soluzioni contenenti microtubuli per prevenire la depolimerizzazione. Per iniziare, la coltura ha modificato geneticamente la linea cellulare HCT116 in terreno di coltura cellulare DMEM fino ad ottenere da sei a 12 piastre confluenti.
Lavare delicatamente le cellule con 10 millilitri di PBS per rimuovere qualsiasi terreno di coltura cellulare. Staccare le cellule dalle piastre incubando le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente con tre millilitri di PBS ghiacciato integrato con EDTA da cinque millimolari e, successivamente, utilizzando un raschietto cellulare. Raccogliere le cellule in un tubo da 50 millilitri su ghiaccio e girare a 250 G per 10 minuti.
Notare il volume delle celle raccolte con la scala volumetrica sul tubo. Risospendere il pellet cellulare raccolto in un volume uguale di tampone di lisi e cellule di lisa mediante sonicazione. Dopo la sonicazione, per l'analisi SDS-PAGE, aggiungere due microlitri di lisato in una provetta contenente 18 microlitri di acqua e cinque microlitri di tampone campione SDS 5X.
Pipettare le cellule lisate rimanenti in un tubo da centrifuga e ruotare a 100.000 G per un'ora a quattro gradi Celsius in un rotore ultracentrifugo per eliminare il lisato. Utilizzando una siringa, rimuovere il lisato eliminato senza disturbare il pellet e lo strato galleggiante sulla parte superiore. Aggiungere due microlitri di lisato eliminato in una provetta contenente 18 microlitri di acqua e cinque microlitri di tampone per campioni SDS 5X.
Risciacquare accuratamente il pellet e raccogliere un po 'di pellet facendo roteare una punta di pipetta P-10 attraverso il pellet. Quindi, aggiungere 200 microlitri di acqua e 50 microlitri di tampone SDS. Aggiungere GTP monomolare e paclitaxel 20 micromolari in un surnatante raccolto per polimerizzare i microtubuli e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire ai microtubuli di assemblarsi.
Preparare il tampone cushion aggiungendo 600 microlitri di glicerolo a 400 microlitri di tampone di lisi e integrare la miscela con paclitaxel da 20 micromolari. Preriscaldare il buffer a 37 gradi Celsius. Aggiungere 800 microlitri di tampone per cuscini in un tubo ultracentrifugo.
Quindi, pipettare accuratamente il lisato integrato con GTP-paclitaxel sopra il buffer del cuscino. Posizionare il tubo in un rotore ultracentrifugo per ruotare a 100.000 G a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Segna il bordo rivolto verso l'esterno del tubo per riconoscere facilmente dove dovrebbe formarsi il pellet di microtubuli.
Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il cuscino con una pipetta senza disturbare il pellet. Aggiungere con attenzione il tampone di lisi accanto al pellet, ruotare il tubo alcune volte per rimuovere quanto più glicerolo possibile dal pellet e dalle pareti del tubo, quindi aspirare e ripetere la fase di lavaggio tre volte. Risospendere delicatamente il pellet lavato con una punta tagliata in tampone di risospensione preriscaldato da 50 microlitri e posizionare il tubo a 37 gradi Celsius.
Aggiungere due microlitri di frazione di pellet risospeso in 18 microlitri di acqua e cinque microlitri di tampone campione SDS 5X. Preparare il dispositivo di congelamento a tuffo installando la carta assorbente. Impostare la temperatura del dispositivo su 30 gradi Celsius e l'umidificazione su 100%Consentire al dispositivo di equilibrarsi per 30 minuti.
Preparare le impostazioni del congelatore a immersione per due applicazioni. Per la prima applicazione, impostare la forza su 10, tempo di macchia di due secondi e tempo di attesa di zero secondi. Per la seconda applicazione, impostare la forza su 10, 6,5 secondi di tempo di macchia e 10 secondi di attesa.
Posizionare le griglie con il loro lato in carbonio verso l'alto nel veicolo di scarico a bagliore metallico. Il bagliore scarica la microscopia crioelettronica, o griglie EM, a 30 milliampere per 60 secondi. Raffreddare il gruppo contenitore in polistirolo con azoto liquido e preparare l'etano liquido in una tazza di metallo condensando il gas etano in una tazza di metallo freddo.
Diluire la proteina che interagisce con i microtubuli in uguale volume con tampone di diluizione prima di applicarla alle griglie per abbassare la concentrazione cellulare. Posizionare il mixer a 37 gradi Celsius. Utilizzare un blocco di metallo caldo in una scatola di polistirolo isolante se non è presente alcun blocco riscaldante vicino al dispositivo di congelamento a tuffo.
Prendi una griglia di scarico a bagliore con pinzette a immersione e fai clic su di esse nel congelatore. Posizionare il contenitore di polistirolo con etano liquido nel congelatore e seguire il programma preparato. In primo luogo, applicare 3,5 microlitri di soluzione di microtubuli alla griglia.
Lascia che il congelatore a tuffo asciughi la griglia. Quindi, applicare immediatamente 3,5 microlitri di proteine diluite. E infine, lasciare che lo stantuffo si asciughi e immerga la griglia nell'etano liquido.
Trasferire le griglie in una scatola di stoccaggio della griglia e conservarle in un Dewar di azoto liquido fino all'imaging. La qualità e la concentrazione dei microtubuli estratti sono state valutate mediante gel SDS colorato con Coomassie. Una linea di regressione non lineare delle quantità BSA relative, derivata dall'interpolazione della banda di microtubuli intorno a 50 kilodalton nella corsia P2 con la curva BSA, indica una concentrazione finale di 1,42 milligrammi per millilitro.
Questo concorda bene con il numero misurato con uno spettrofotometro da due persone. I microtubuli appena estratti sono stati utilizzati per realizzare campioni crio-EM. I microtubuli appaiono intatti e abbondanti sulle micrografie.
La densità dei microtubuli per micrografia non dovrebbe essere troppo elevata per evitare che i microtubuli si incrocino l'uno sull'altro. I microtubuli rotti indicano che i microtubuli sono depolimerizzati o che la concentrazione di microtubuli era troppo densa. I microtubuli legati a MATCAP avevano bordi ruvidi caratterizzati da punti densi di elettroni sulla superficie del microtubulo.
I microtubuli legati a MATCAP e non legati a MATCAP potrebbero anche essere distinti nelle classi 2D calcolate. Realizzare griglie crio-EM con questo metodo può permettere di studiare la struttura dei microtubuli legati ad una specifica proteina interagente. Questo può portare ad una migliore comprensione dei meccanismi della biologia cellulare strutturale.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'estrazione di tubulina endogena da cellule di mammifero, che consente la preparazione di microtubuli arricchiti per modifiche specifiche. I microtubuli estratti possono quindi essere marcati con proteine leganti i microtubuli purificate per l'analisi mediante microscopia elettronica criogenica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Microscopia crioelettronica
Sfondo
- I microtubuli svolgono un ruolo fondamentale nella struttura e nella funzione cellulare.
- Comprendere le interazioni dei microtubuli è essenziale per chiarire i meccanismi cellulari.
- La microscopia crioelettronica fornisce informazioni strutturali ad alta risoluzione.
- Le modifiche post-traduzionali controllate dei microtubuli sono importanti per gli studi funzionali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo semplice ed economico per l'estrazione dei microtubuli.
- Permettere la preparazione di microtubuli omogenei per studi strutturali.
- Facilitare la decorazione dei microtubuli con proteine leganti per la microscopia crioelettronica (cryo-EM).
Metodi Utilizzati
- Coltivazione di cellule HCT116 geneticamente modificate in mezzo DMEM.
- Lisi cellulare ed estrazione dei microtubuli mediante sonificazione e ultracentrifugazione.
- Polimerizzazione dei microtubuli con GTP e paclitaxel.
- Preparazione delle griglie per microscopia criogenica ed immersione in azoto liquido dei campioni di microtubuli.
Risultati principali
- I microtubuli estratti sono stati valutati per qualità e concentrazione.
- I microtubuli apparivano integri e abbondanti nelle microfotografie di microscopia elettronica criogenica.
- Condizioni controllate hanno impedito la depolimerizzazione dei microtubuli durante la preparazione.
- Sono state osservate caratteristiche distinte dei microtubuli legati a MATCAP.
Conclusioni
- Il protocollo consente l'estrazione e la modifica efficace dei microtubuli.
- Possono essere preparati microtubuli di alta qualità per analisi strutturali dettagliate.
- Questo metodo contribuisce alla comprensione della dinamica e delle interazioni dei microtubuli.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'estrazione controllata di microtubuli modificati post-traduzionalmente da cellule di mammifero permette un'analisi precisa dei complessi microtubuli-proteine, un punto critico per la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta. Questo flusso di lavoro supporta una maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi e fornisce informazioni strutturali essenziali per lo sviluppo di sistemi rilevanti per le malattie. La riproducibilità e la scalabilità del protocollo lo posizionano come una capacità riutilizzabile per i portafogli di ricerca e sviluppo biofarmaceutici focalizzati su bersagli citoscheletrici e reti di interazione proteica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'isolamento di microtubuli con modifiche post-traduzionali definite per studi basati su ipotesi.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica consentendo la valutazione diretta delle interazioni proteina-microtubulo.
- Facilita la validazione funzionale del bersaglio mediante caratterizzazione strutturale dei complessi.
- Fornisce un'elevata affidabilità predittiva per la selezione di bersagli citoscheletrici nei percorsi di scoperta.
Sviluppo di screening e saggi
- Genera preparati omogenei di microtubuli adatti a saggi di legame e strutturali successivi.
- Standardizza la qualità del campione e lo stato di modificazione, migliorando la riproducibilità dei saggi.
- Consente la valutazione quantitativa del legame proteico mediante risultati di criomicroscopia eletttronica e SDS-PAGE.
- Prepara sistemi validati per flussi di lavoro affidabili di screening di composti o proteine.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati strutturali alle modifiche post-traduzionali rilevanti per la patologia, coinvolte nella patogenesi.
- Supporta la continuità dalla scoperta molecolare alla validazione del modello preclinico per i bersagli del citoscheletro.
- Riduce il rischio di traduzione terapeutica chiarificando i meccanismi alla base dei complessi proteina-microtubuli.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di estrazione e preparazione per microscopia crioelettronica si inserisce nell'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, consentendo studi strutturali e meccanicistici che guidano la ricerca preclinica successiva.
- Biologia della scoperta: Fornisce una piattaforma per la verifica di ipotesi e la chiarificazione di percorsi attraverso stati controllati di modificazione.
- Screening: Fornisce campioni riproducibili di microtubuli specifici per la modificazione, adatti a saggi quantitativi di legame e analisi strutturali.
- Analisi: Permette la misurazione del legame proteico e dell'integrità dei microtubuli mediante analisi SDS-PAGE e risultati ottenuti con microscopia crioelettronica (cryo-EM).
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte a livello molecolare a sistemi rilevanti per le malattie, consentendo lo studio di modificazioni coinvolte in ambito clinico.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo scalabile e standardizzato, adattabile a diversi bersagli proteici e modelli cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del target.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la capacità analitica per gli studi strutturali.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento/cessazione e l'efficienza del capitale chiarificando l'interazione con il target.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei target citoscheletrici e dei complessi proteici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare di mammiferi, nell'estrazione delle proteine e nella preparazione dei campioni per microscopia elettronica criogenica.
- Richiede l'accesso a strumentazione per ultracentrifugazione, congelamento rapido e microscopia elettronica criogenica.
- Necessita di un rigoroso controllo della temperatura per mantenere l'integrità dei microtubuli.
- La standardizzazione tra i gruppi di lavoro è essenziale per la riproducibilità e il confronto dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse linee cellulari o profili di modifiche post-traduzionali.
