Name: Preparazione di isole fetali di primati non umani congelate per il sequenziamento combinato di RNA a nuclei singoli e il sequenziamento ATAC e la metabolomica di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: Impara a isolare nuclei da isole pancreatiche di primati non umani congelati per sequenziamento RNA e ATAC simultaneo. Questo protocollo consente analisi metabolomiche e genomiche integrate dallo stesso campione.

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<meta charset="utf8"></head><body>Dall'RNA ai metaboliti: profilazione multi-omica delle isole fetali di primati non umani

<ol><li>Christensen, A. A., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Diab+Rep%22%5BJournal%5D)">The beta cell in type 2 diabetes.</a> Curr Diab Rep. 19 (9), 81(2019).</li>
<li>Elsakr, J. M., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+programming+of+the+pancreatic+islet+by%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental programming of the pancreatic islet by.</a> Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).</li>
<li>Salzberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+and+lifestyle+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Prim+Care%22%5BJournal%5D)">Risk factors and lifestyle interventions.</a> Prim Care. 49 (2), 201-212 (2022).</li>
<li>Pound, L. D., Kievit, P., Grove, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+non-human+primate+as+a+model+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Endocrinol+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">The non-human primate as a model for type 2 diabetes.</a> Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 21 (2), 89-94 (2014).</li>
<li>Kang, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA+sequencing+of+human+pancreatic+islets+identifies+novel+gene+sets+and+distinguishes+%CE%B2-cell+subpopulations+with+dynamic+transcriptome+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes β-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles.</a> Genome Med. 15 (1), 30(2023).</li>
<li>Basile, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single-nucleus+RNA-sequencing+to+interrogate+transcriptomic+profiles+of+archived+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Using single-nucleus RNA-sequencing to interrogate transcriptomic profiles of archived human pancreatic islets.</a> Genome Med. 13 (1), 128(2021).</li>
<li>Cabé, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+brain+and+bone+marrow+nuclei+preparation+for+single+nuclei+multiome+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-quality brain and bone marrow nuclei preparation for single nuclei multiome assays.</a> J Vis Exp. (202), e65715(2023).</li>
<li>Nuclei from embryonic mouse brain for single cell multiome ATAC + gex sequencing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com">https://www.10xgenomics.com</a> (2022).</li>
<li>Elsakr, J. M., Deeter, C., Ricciardi, V., Gannon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+non-human+primate+pancreatic+islet+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of non-human primate pancreatic islet oxygen consumption.</a> J Vis Exp. (154), e60696(2019).</li>
<li>Chromium next gem single cell multiome ATAC + gene expression reagent kits user guide. , Available from: 
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<li>Maruyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+aqueous+metabolites+from+cultured+adherent+cells+for+metabolomic+analysis+by+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis by capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (148), e59551(2019).</li>
<li>Ooga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+anatomy+of+an+animal+model+revealing+homeostatic+imbalances+in+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia.</a> Mol Biosyst. 7 (4), 1217-1223 (2011).</li>
<li>Ohashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depiction+of+metabolome+changes+in+histidine-starved+Escherichia+coli+by+CE-TOFMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS.</a> Mol Biosyst. 4 (2), 135-147 (2008).</li>
<li>Chiou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+identifies+pancreatic+islet+cell+type%E2%80%93+and+state-specific+regulatory+programs+of+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility identifies pancreatic islet cell type– and state-specific regulatory programs of diabetes risk.</a> Nat Genetics. 53 (4), 455-466 (2021).</li>
<li>Pang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaboanalyst+6.0%3A+Towards+a+unified+platform+for+metabolomics+data+processing%2C+analysis+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation.</a> Nucleic Acids Res. , 253(2024).</li>
<li>Willency, J. A., Lin, Y., Pirro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+in+human+and+animal+biofluids+and+tissues+using+liquid+chromatography+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics in human and animal biofluids and tissues using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry.</a> STAR Protoc. 5 (1), 102884(2024).</li>
<li>Behnke, J. -S., Urner, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+mass+spectrometry+detergents+for+membrane+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Emergence of mass spectrometry detergents for membrane proteomics.</a> Anal Bioanal Chem. 415 (18), 3897-3909 (2023).</li>
<li>Ouimet, C. M., D'amico, C. I., Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+capillary+electrophoresis+and+the+implications+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in capillary electrophoresis and the implications for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 213-224 (2017).</li>
<li>Alexandrov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+metabolomics+and+imaging+mass+spectrometry+in+the+age+of+artificial+intelligence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Data+Sci%22%5BJournal%5D)">Spatial metabolomics and imaging mass spectrometry in the age of artificial intelligence.</a> Annu Rev Biomed Data Sci. 3, 61-87 (2020).</li>
<li>Ewald, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+multi-omics+integration+using+the+analyst+software+suite%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Web-based multi-omics integration using the analyst software suite.</a> Nat Protoc. 19, 1467-1497 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>33 G iniettore di cannula cerebrale di ratto</td><td>Protech International</td><td>8IC315IS5SPC</td><td>Per incannulamento del dotto e gonfiaggio del pancreas</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Fisher</td><td>15-140-122</td><td>Per terreni RT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Millipore/Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Per supporti RT</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-875-135</td><td>Per terreni RT</td></tr><tr><td>Collagenasi P</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11213865001</td><td>Per la digestione del pancreas</td></tr><tr><td>Dnasi bovina I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11284932001</td><td>Per terreni RT e isolamento</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td> La <td>concentrazione finale sarà di 2,8 mM</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher</td><td>C4901-500G</td><td>La concentrazione finale sarà 0,5 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Final la concentrazione sarà di 10 mM</td></tr><tr><td>Frazione di albumina sierica bovina (BSA) 5</td><td>Prodotti di ricerca International</td><td>A30075100</td><td>La concentrazione finale sarà di 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle</td><td>Medium Gibco</td><td>11966025</td><td>Per la raccolta manuale delle isole</td></tr><tr><td>20x Nuclei Buffer</td><td>10X Genomics</td><td>2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin (5%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2006</td><td>Potrebbe essere necessario riscaldare la digitonina a 65 gradi C per sciogliere il precipitato bianco</td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30 &; micro; M)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Soluzione madre (10%)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>i8896</td><td>Preparare un brodo al 10% utilizzando acqua MilliQ</td></tr><tr><td>Soluzione di cloridrato Trizma, pH 7,5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2319-1L</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di sodio, 5 M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6546-1L</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di magnesio, 1 M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Sigma Protector Inibitore della RNASI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Research Products International</td><td>D11000-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Pestelli monouso per pellet senza RNASI</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td>Preparare una riserva al 20% utilizzando acqua MilliQ</td></tr>, <tr><td>acqua priva di nucleasi</td>, <td>Promega</td><td>PR-P1193</td><td></td></tr>, <tr><td>DNA LoBind Tubes (5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials (1,5 mL)</td><td>VWR</td><td>20170-225</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click Tubes (0,6 mL)</td><td>Denville</td><td>C-2177</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-10282</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per conteggio cellulare a doppia camera</td><td>Bio-Rad</td><td>1450011</td><td></td></tr><tr><td>Sistema per acqua ultrapura MiiliQ</td><td>Millipore/Sigma</td><td>7003/05/10/15</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di cut-off da 5 kDa</td><td>HMT Metabolome Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard interni</td><td>HMT Metabolome Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette P10, P20, P200 e P1000</td><td>Eppendorf</td><td>2231000602</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 10 &; L</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 1000 &; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 20 & micro; L</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-404</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 200 &; micro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase</td><td>Olympus</td><td>BX41-PH-B</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Contatore di cellule automatizzato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30R</td><td>Centrifuga Beckman-Coulter</td><td>B06315</td><td></td></tr><tr><td>RNase-ZAP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2020</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di isole fetali di primati non umani congelate per il sequenziamento combinato di rna a nuclei singoli e il sequenziamento atac e la metabolomica di massa

Preparation of Frozen Non-Human Primate Fetal Islets for Combined Single Nuclei RNA-Sequencing and ATAC-Sequencing, and Bulk Metabolomics

La qualità dei risultati del sequenziamento dipende fortemente dalla qualità dell'input nucleare. Il blebbing nucleare e il danneggiamento della membrana nucleare esterna provocheranno una contaminazione dell'RNA e del DNA nell'analisi, che introdurrà rumore nei dati. Un estratto nucleare puro avrà un'evidenza minima di nuclei incapsulati con componenti citoplasmatici (Figura 2A) o di sovradigestione, evidenziata dallo scoppio dei nuclei (Figura 2B). Un input nucleare ideale conterrà nuclei intatti (Figura 2C).
I dettagli dell'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA e dell'ATAC a nucleo singolo sono ampiamente forniti altrove 5,14. Cluster rappresentativi di popolazioni cellulari da una preparazione nucleare fetale di NHP sono illustrati tramite UMAP nella Figura 3A. I dati di metabolomica vengono prontamente analizzati utilizzando software open source, come descritto in precedenza15. Gli spettri generati possono essere visualizzati e i metaboliti arricchiti nelle isole di un feto provenienti da una madre alimentata con WSD possono essere confrontati con quelli di una madre alimentata con CD (Figura 3B-F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66849/66849fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del protocollo per l'isolamento dei nuclei e della frazione citosolica. Le isole pancreatiche fetali sono state conservate a -80 °C fino al giorno del test. I nuclei sono stati isolati e utilizzati per il sequenziamento di RNA e ATAC a nucleo singolo. La frazione citosolica dopo il primo lavaggio di isolamento dei nuclei è stata mantenuta per l'elettroforesi capillare-spettrometria di massa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66849/66849fig02.jpg"> Figura 2: Dimostrazione dell'input corretto dei nuclei nel saggio multiomico a nucleo singolo. Esempi di (A) Nucleo incapsulato dal citoplasma, (B) Nucleo esplosivo con membrana nucleare compromessa e (C) Nucleo intatto con morfologia arrotondata. Barre di scala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66849/66849fig03.jpg"> Figura 3: Dati rappresentativi dalla multiomica combinata a nucleo singolo e dalla metabolomica di massa. (A) Clustering UMAP di sottotipi cellulari all'interno di isole NHP fetali isolate in base all'espressione genica. Stima quantitativa dei metaboliti glicolitici, (B) diidrossiacetone fosfato e (C) glicerolo-3-fosfato nella frazione citosolica da isole fetali isolate di NHP quando la madre è stata alimentata con una WSD (mWSD) o una CD (mCD). La dieta materna può anche regolare in modo differenziale il metabolismo attraverso il ciclo dell'acido citrico (D) (2-ossoglutarato), il metabolismo degli aminoacidi (creatina) (E) e alterando lo stato redox cellulare (Glutatione) nelle isole fetali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Formulazioni tampone per l'isolamento dei nuclei. Vengono mostrati i componenti dettagliati dei nuclei, della lisi, della diluizione della lisi e dei tamponi di lavaggio. Se necessario, diluire i reagenti alla concentrazione madre prima di preparare il tampone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66849/66849_Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Preparazione di isole fetali di primati non umani congelate per il sequenziamento combinato di RNA a nuclei singoli e il sequenziamento ATAC e la metabolomica di massa

One challenge in studies using tissue collected from multiple cohorts is avoiding batch effects when preparing for large-scale multi-omic experiments, ...

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Impara a isolare nuclei da isole pancreatiche di primati non umani congelati per sequenziamento RNA e ATAC simultaneo. Questo protocollo consente analisi metabolomiche e genomiche integrate dallo stesso campione.

Preparazione di isole fetali di primati non umani congelate per il sequenziamento combinato di RNA a nuclei singoli e il sequenziamento ATAC e la metabolomica di massa (Video) | JoVE Journal

Preparazione di isole fetali di primati non umani congelate per il sequenziamento combinato di RNA a nuclei singoli e il sequenziamento ATAC e la metabolomica di massa

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