Preparazione di isole fetali di primati non umani congelate per il sequenziamento combinato di RNA a nuclei singoli e il sequenziamento ATAC e la metabolomica di massa
November 8th, 2024
Questo protocollo descrive le procedure per isolare nuclei di alta qualità da isole pancreatiche congelate di primati non umani per l'uso nel sequenziamento simultaneo di RNA a singolo nucleo e nel sequenziamento ATAC, preservando la frazione citosolica di massa per le analisi metabolomiche dagli stessi campioni.
Utilizziamo un modello altamente traslazionale di primati non umani per valutare come la dieta materna e il consumo di farmaci durante la gravidanza influenzino lo sviluppo embrionale e la funzione postnatale delle isole pancreatiche nella prole. I cambiamenti programmati in base allo sviluppo potrebbero alterare la suscettibilità alla malattia più avanti nella vita. Una sfida quando si lavora con campioni difficili da acquisire, come quelli provenienti da primati non umani, è valutare in modo efficiente più domande dello stesso individuo.
Sfortunatamente, l'estrazione simultanea di informazioni dal metaboloma e dal genoma può essere difficile a causa dell'incompatibilità dei reagenti del saggio nella degradazione sensibile al tempo delle molecole da quantificare. Il nostro protocollo consente l'estrapolazione dell'abbondanza dei metaboliti, dell'accessibilità della cromatina e dell'espressione genica differenziale dallo stesso materiale di partenza. Questo approccio a più livelli fornisce informazioni su come il metabolismo può alterare il genoma nelle isole pancreatiche.
Panoramica
Questo protocollo delinea metodi per isolare nuclei di alta qualità da isole pancreatiche di primati non umani congelati per il sequenziamento simultaneo di RNA e sequenziamento ATAC. Preserva inoltre la frazione citosolica di massa per analisi metabolomiche, consentendo una comprensione completa delle interazioni metaboliche e genomiche.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Metabolomica
Contesto
- I modelli di primati non umani sono cruciali per studiare i meccanismi delle malattie umane.
- La dieta e la medicazione materna possono influenzare lo sviluppo delle isole pancreatiche della prole.
- L'analisi simultanea del metaboloma e del genoma è difficile a causa del degrado del campione.
- Questo studio affronta la necessità di analisi multi-livello efficienti da campioni limitati.
Obiettivo dello studio
- Valutare l'impatto dei fattori materni sullo sviluppo delle isole pancreatiche embrionali.
- Esplorare come i cambiamenti metabolici possono influenzare l'espressione genomica.
- Sviluppare un protocollo che consenta un'analisi completa dallo stesso campione.
Metodi utilizzati
- Isolamento di nuclei dalle isole pancreatiche.
- Sequenziamento simultaneo di RNA e sequenziamento ATAC.
- Preservazione di frazioni citosoliche per studi metabolomici.
- Analisi multi-livello per valutare l'abbondanza di metaboliti e l'espressione genica.
Principali risultati
- Isolamento con successo di nuclei e frazioni citosoliche di alta qualità.
- Incontri su come la dieta materna influenzi la funzione delle isole pancreatiche.
- Fattibilità dimostrata di analisi genomiche e metabolomiche simultanee.
- Rivelare potenziali collegamenti tra metabolismo ed espressione genica nelle isole.
Conclusioni
- Questo protocollo consente un'analisi completa delle isole pancreatiche.
- I risultati possono informare futuri studi sulla suscettibilità alle malattie.
- Evidenzia l'importanza delle influenze materne sulla salute della prole.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Integrating single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq, and bulk metabolomics from frozen non-human primate islets addresses a critical bottleneck in multi-omic discovery using rare or precious samples. This approach enables comprehensive molecular profiling from limited material, supporting predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. The protocol maximizes data yield per sample, informing risk-adjusted portfolio decisions in metabolic and developmental disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic and epigenetic mechanisms underlying cellular identity in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by linking metabolite abundance to gene expression and chromatin accessibility.
- Facilitates mechanistic de-risking by integrating multi-layered molecular data from the same biological source.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nuclei and cytosolic fractions for downstream high-throughput sequencing and metabolomics workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing batch effects across multi-cohort studies.
- Enables quantitative, multi-omic outputs for robust compound or perturbation evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular readouts with disease-relevant metabolic and epigenetic biomarkers in translational models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by leveraging non-human primate systems.
- Provides predictive insights into developmental programming and disease susceptibility mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery, target validation, and translational research by enabling multi-omic profiling from rare tissue samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on metabolic-epigenetic interactions in islet development.
- Screening: Delivers reproducible nuclei and metabolite preparations for scalable omics assays.
- Analytics: Provides quantitative gene expression, chromatin accessibility, and metabolite abundance data for comparative analyses.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant phenotypes in non-human primate models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for maximizing data extraction from limited or archival samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes multi-omic sample preparation and minimizes batch effects.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient use of rare samples.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of metabolic and developmental disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nuclei isolation, single-nucleus sequencing, and metabolomics workflows.
- Demands access to high-throughput sequencing and mass spectrometry infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to control for batch effects.
- Adaptable to other tissue types but may require protocol optimization for different sample matrices.
- Sample scarcity and degradation sensitivity impose practical limitations on throughput and timing.
