Preparazione di isole fetali di primati non umani congelate per il sequenziamento combinato di RNA a nuclei singoli e il sequenziamento ATAC e la metabolomica di massa
8 novembre 2024
Questo protocollo descrive le procedure per isolare nuclei di alta qualità da isole pancreatiche congelate di primati non umani per l'uso nel sequenziamento simultaneo di RNA a singolo nucleo e nel sequenziamento ATAC, preservando la frazione citosolica di massa per le analisi metabolomiche dagli stessi campioni.
Utilizziamo un modello altamente traslazionale di primati non umani per valutare come la dieta materna e il consumo di farmaci durante la gravidanza influenzino lo sviluppo embrionale e la funzione postnatale delle isole pancreatiche nella prole. I cambiamenti programmati in base allo sviluppo potrebbero alterare la suscettibilità alla malattia più avanti nella vita. Una sfida quando si lavora con campioni difficili da acquisire, come quelli provenienti da primati non umani, è valutare in modo efficiente più domande dello stesso individuo.
Sfortunatamente, l'estrazione simultanea di informazioni dal metaboloma e dal genoma può essere difficile a causa dell'incompatibilità dei reagenti del saggio nella degradazione sensibile al tempo delle molecole da quantificare. Il nostro protocollo consente l'estrapolazione dell'abbondanza dei metaboliti, dell'accessibilità della cromatina e dell'espressione genica differenziale dallo stesso materiale di partenza. Questo approccio a più livelli fornisce informazioni su come il metabolismo può alterare il genoma nelle isole pancreatiche.
Panoramica
Questo protocollo descrive i metodi per isolare nuclei di alta qualità da isole pancreatiche di primati non umani congelate, al fine di effettuare contemporaneamente il sequenziamento dell'RNA e il sequenziamento ATAC. Conserva inoltre la frazione citosolica bulk per analisi metabolomiche, consentendo una comprensione completa delle interazioni metaboliche e genomiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Metabolomica
Sfondo
- I modelli di primati non umani sono fondamentali per lo studio dei meccanismi delle malattie umane.
- La dieta e i farmaci assunti dalla madre possono influenzare lo sviluppo delle isole pancreatiche della prole.
- L'analisi simultanea del metaboloma e del genoma è difficoltosa a causa del degrado del campione.
- Questo studio affronta la necessità di analisi multilivello efficienti a partire da campioni limitati.
Scopo dello studio
- Valutare l'impatto dei fattori materni sullo sviluppo delle isole pancreatiche embrionali.
- Esplorare come i cambiamenti metabolici possano influenzare l'espressione genómica.
- Sviluppare un protocollo che consenta un'analisi completa a partire dallo stesso campione.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di nuclei da isole pancreatiche.
- Sequenziamento simultaneo di RNA e sequenziamento ATAC.
- Conservazione delle frazioni citosoliche per studi metabolomici.
- Analisi multilivello per valutare l'abbondanza di metaboliti e l'espressione genica.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di nuclei e frazioni citosoliche di alta qualità.
- Informazioni su come la dieta materna influisce sulla funzione degli isolotti pancreatici.
- Dimostrata la fattibilità di analisi genomiche e metabolomiche simultanee.
- Evidenziati potenziali collegamenti tra metabolismo ed espressione genica negli isolotti.
Conclusioni
- Questo protocollo consente un'analisi completa delle isole pancreatiche.
- I risultati potrebbero orientare futuri studi sulla suscettibilità alle malattie.
- Evidenzia l'importanza delle influenze materne sulla salute della prole.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'integrazione di RNA-seq da singolo nucleo, ATAC-seq e metabolomica globale da isolotti di primati non umani congelati affronta un collo di bottiglia critico nella scoperta multi-omica utilizzando campioni rari o preziosi. Questo approccio consente un profilo molecolare completo a partire da materiale limitato, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nella validazione precoce dei bersagli e nella riduzione dei rischi meccanicistici. Il protocollo massimizza il rendimento di dati per campione, fornendo informazioni per decisioni di portafoglio corrette in base al rischio nella ricerca su malattie metaboliche e dello sviluppo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dei meccanismi metabolici ed epigenetici alla base dell'identità cellulare in sistemi rilevanti per le malattie.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli collegando l'abbondanza di metaboliti all'espressione genica e all'accessibilità della cromatina.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico integrando dati molecolari multilivello provenienti dalla stessa fonte biologica.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara frazioni nucleare e citosolica validate per analisi di sequenziamento ad alto rendimento e metabolomica.
- Migliora la riproducibilità e la standardizzazione dei saggi riducendo al minimo gli effetti di lotto negli studi su più coorti.
- Consente output quantitativi multi-omici per una valutazione robusta di composti o perturbazioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i parametri molecolari a biomarcatori metabolici ed epigenetici rilevanti per la malattia nei modelli traslazionali.
- Permette una continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica sfruttando sistemi di primati non umani.
- Fornisce informazioni predittive sui meccanismi di programmazione dello sviluppo e di suscettibilità alle malattie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo collega la fase iniziale della scoperta, la validazione del bersaglio e la ricerca traslazionale, permettendo il profiling multi-omico da campioni di tessuto rari.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle interazioni metabolico-epigenetiche nello sviluppo delle isole pancreatiche.
- Screening: Fornisce preparati riproducibili di nuclei e metaboliti per saggi omici scalabili.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi sull'espressione genica, sull'accessibilità della cromatina e sull'abbondanza di metaboliti per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati molecolari a fenotipi rilevanti per le malattie in modelli di primati non umani.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile per massimizzare l'estrazione di dati da campioni limitati o archiviati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca delle fasi iniziali.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione dei campioni multi-omici e minimizza gli effetti di lotto.
- Valore strategico: Permette decisioni di prosecuzione/cessazione più informate e un uso capital-efficiente di campioni rari.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio dei programmi su malattie metaboliche e dello sviluppo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di nuclei, nel sequenziamento di singoli nuclei e nei protocolli di metabolomica.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per il sequenziamento ad alto rendimento e la spettrometria di massa.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per controllare gli effetti di batch.
- È adattabile ad altri tipi di tessuto, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo per diverse matrici campionarie.
- La scarsità del campione e la sensibilità alla degradazione impongono limitazioni pratiche sulla produttività e sui tempi.
