Preparazione di Mycobacterium abscessus incluso nella perla di agar per inoculare topi immunocompetenti per via intratracheale

Stiamo sviluppando un modello murino di infezione polmonare cronica da ascesso da micobatterio per testare l'efficacia degli antibiotici in studi preclinici. La prima sfida è superare la resistenza intrinseca dei topi agli ascessi dei micobatteri. La seconda sfida consiste nel generare un lotto riproducibile di batteri incorporati nell'agar beat per l'infezione intratracheale. Vogliamo condividere un protocollo dettagliato di preparazione e infezione dell'agar beat che può essere facilmente implementato da altri laboratori per testare nuovi farmaci nei topi.

Infettare con i batteri incorporati nell'agar invece che con i batteri liberi, supera parzialmente la capacità dei topi immunocompetenti di eliminare spontaneamente l'infezione. Questo modello fornisce un robusto strumento preclinico per la valutazione di nuovi antibiotici contro il mycobacterium abscessus, facilitando la scoperta e lo sviluppo di antibiotici molto necessari contro le infezioni polmonari.

[Istruttore] Per iniziare, ottenere colture in sospensione di mycobacterium abscessus in crescita esponenziale regolate a una densità ottica di 30. Trasferire 27 millilitri di coclea di soia trittica fusa pre-bilanciata a 50 gradi Celsius in un tubo contenente tre millilitri di sospensione batterica. Miscelare la sospensione mediante pipettaggio. Pipettare con cura la miscela di coclea batterica in un pallone contenente 60 millilitri di olio minerale in un pallone. Posizionare il pallone in un contenitore secondario e iniziare immediatamente a mescolare a velocità media su un agitatore magnetico utilizzando una barra di agitazione magnetica. Assicurarsi che si formi un vortice visibile nella miscela della coclea dell'olio e continuare a mescolare per sei minuti a temperatura ambiente. Mettere il ghiaccio nel contenitore secondario per consentire alla sospensione di raffreddarsi. Quindi trasferire la miscela di liquame in provette da centrifuga da 250 millilitri. Centrifugare la sospensione a 3.700 G per sei minuti a quattro gradi Celsius per i primi cinque cicli e risospendere il pellet a cordone della coclea con DPBS. Inoltre, assemblare un filtro a imbuto, un anello di collegamento e un tubo da 50 millilitri in un'unica unità. Dopo il 10° lavaggio, risospendere il pellet e diluire la sospensione del tallone quattro volte. Aggiungere il materiale campione diluito sul filtro per filtrare la sospensione del cordone. Tirare lentamente, tirare il pistone di una siringa da 30 millilitri collegata all'anello del connettore per creare l'aspirazione e migliorare la filtrazione. Quindi centrifugare la sospensione diluita a 1000 G per due minuti per concentrarla. Dopo aver tirato i pellet di perline in un tubo da 50 millilitri, conservali a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana, ma prepara perline fresche per ogni lotto di esperimenti. Per iniziare, trattieni i mouse CD one sedati utilizzando un supporto tridimensionale stampato-inclinato progettato su misura. Fissare il mouse per gli incisivi utilizzando una corda di sutura attaccata all'asta centrale del supporto. Posizionamento del mouse in una postura sdraiata ventrale con la testa sollevata. Collegare un ago metallico per l'alimentazione degli animali calibro 24 a una siringa di vetro riempita con sospensione di perline a coclea di mycobacterium abscessus. Posizionare clip o tappi di nylon sullo stantuffo per garantire un volume di inoculo controllato di 50 microlitri per topo. Ora, posiziona l'ago della sonda magnetica verticalmente sopra il mouse. Inserire con cautela l'ago nella parte superiore e farlo scorrere più in basso nella trachea. Rimuovere la clip o il tappo di nylon ed erogare lentamente 50 microlitri di sospensione di perline a coclea di mycobacterium abscessus nei polmoni. Lascia riposare il mouse per cinque minuti. Quindi ripetere la procedura di inoculazione una seconda volta per garantire una deposizione profonda e riproducibile dell'intero inoculo nei polmoni. Le perle di coclea contenenti mycobacterium abscessus esprimevano la proteina fluorescente mCherry red e variavano in dimensioni da circa 70 a 250 micrometri. La carica batterica in sei preparazioni di perle indipendenti ha mostrato un'elevata riproducibilità. L'enumerazione batterica prima e dopo il passaggio attraverso la siringa di vetro non ha mostrato alcuna perdita significativa di carica batterica. Il metodo di inoculazione intertracheale è risultato riproducibile in tre preparazioni di microsfere indipendenti, come dimostrato dalla conta delle CFU polmonari a 24 ore dall'infezione. La riproducibilità dell'infezione tra tre operatori indipendenti è stata confermata poiché la conta delle CFU polmonari a 24 ore dopo l'infezione è rimasta coerente in tutti i gruppi.