Separazione e caratterizzazione differenziale delle vescicole extracellulari microbiche intestinali in ratti sensibili al sale in condizioni di dieta ad alto contenuto di sale

Questa ricerca esplora il ruolo delle vescicole extracellulari microbiche intestinali nei ratti ipertesi sensibili al sale con una dieta ricca di sale, esaminando come una dieta ricca di sale altera le vescicole e influenza le interazioni ipertese e immunitarie. I recenti progressi in questo campo includono la comprensione del ruolo delle vescicole extracellulari microbiche intestinali nell'ipertensione, la valutazione dell'impatto delle diete ad alto contenuto di sale sulla diversità microbica e l'implementazione di interventi a base vegetale mirati alle vescicole dalla regolazione metabolica e immunitaria. Le attuali sfide sperimentali includono l'isolamento di vescicole extracellulari ad alta priorità, la distinzione di vescicole derivate anche da quelle del microbioma, la riduzione al minimo della perdita di campione nei protocolli di tintura standard per garantire la riproducibilità tra gli studi. Questa griglia di densità e il protocollo di centrifugazione offrono una priorità più elevata alle vescicole extracellulari con una migliore integrità e riproducibilità rispetto ai metodi tradizionali, consentendo una ricerca più affidabile sulle vescicole extracellulari del microbioma intestinale negli studi sull'ipertensione.

[Narratore] Per iniziare, trasferisci cinque grammi di feci in una provetta da centrifuga da 50 millilitri pre-pesata. Aggiungere 50 millilitri di PBS preriscaldato a 37 gradi Celsius privo di endotossine al tubo e ruotare il tubo per 30 minuti. Raffreddare la centrifuga ad alta velocità a 4 gradi Celsius. Quindi posizionare il campione simmetricamente nella centrifuga e centrifugare a 8.000 G per 15 minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga sterile. Dopo aver centrifugato nuovamente per 15 minuti, aspirare con cura il surnatante e utilizzarlo per ulteriori analisi. Posizionare un'unità filtro sterile da 0,22 micrometri sul ghiaccio. Trasferire il surnatante sulla parte superiore del filtro e accendere la pompa a vuoto per raccogliere i campioni filtrati. Trasferire il filtrato in un filtro centrifugo con un cutoff di 10 kilodalton e una capacità di 15 millilitri. Centrifugare a 4 gradi Celsius 3000G per 30 minuti per concentrare il campione ad almeno 1.400 microlitri. Posizionare immediatamente il campione sul ghiaccio. Mescolare un volume di tampone gradiente A con cinque volumi di mezzo gradiente di densità per preparare la soluzione di lavoro. Preparare una soluzione di iodixanolo al 10% mescolando un'unità di soluzione di lavoro con quattro unità di tampone B. Allo stesso modo, mescolare due unità di soluzione di lavoro con tre unità di tampone B per una soluzione di iodixanolo al 20% e quattro unità di soluzione di lavoro con un'unità di tampone B per una soluzione di iodixanolo al 40%. Mescolare ora il campione concentrato preparato in precedenza con sette millilitri di terreno a gradiente di densità per ottenere una soluzione di iodixanolo al 50%. Per preparare un gradiente di densità, aggiungere la soluzione di blu di tripano alle soluzioni di iodixanolo al 40% e al 10%. Trasferire otto millilitri di soluzione di iodixanolo al 50% sul fondo di una provetta da centrifuga in polipropilene a parete sottile. Inclinare il tubo a 70 gradi e trasferire otto millilitri di soluzione di iodixanolo al 40% sulla superficie del liquido. Successivamente, aggiungi otto millilitri di soluzione di iodixanolo al 20%, seguiti da sette millilitri di soluzione di iodixanolo al 10% e due millilitri di PBS privo di endotossine. Prendere la provetta preparata per il gradiente di densità e inserirla in un'ultracentrifuga pre-raffreddata. Imposta i parametri di ultracentrifugazione su 100.000 G, 20 ore e 10 gradi Celsius e inizia la corsa. Per la separazione manuale della densità del gradiente per la raccolta, il gradiente di densità è di circa 34 millilitri di liquido. Due millilitri di soluzione vengono estratti lentamente dal centro della superficie del liquido e ogni soluzione da due millilitri è un gradiente. Quindi la soluzione del gradiente di densità è divisa in 17 gradienti. Infine, utilizzando una pipetta, trasferire le frazioni di densità in provette sterili e posizionarle immediatamente sul ghiaccio. L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle ha rivelato le dimensioni, la distribuzione e i profili di concentrazione delle vescicole extracellulari raccolte da diverse frazioni di gradiente di densità. La maggior parte delle vescicole extracellulari in tutte le frazioni erano concentrate nell'intervallo di dimensioni da 30 a 100 nanometri seguendo un tipico modello di distribuzione. La concentrazione di vescicole extracellulari ha raggiunto il suo livello più alto nella frazione nove, con un picco di circa 3,85 volte 10 alla potenza di nove particelle per millilitro. Il contenuto proteico, misurato utilizzando un kit di acido bicinconinnico, era anche più alto nella frazione nove a 0,417 microgrammi per microlitro. Inoltre, i livelli di espressione dei lipopolisaccaridi, determinati utilizzando un kit di rilevamento delle endotossine, erano significativamente elevati nelle frazioni nove e 10. Maggiori quantità di proteine sono state osservate anche nella frazione nove durante l'analisi elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato di poliacrilammide. La microscopia elettronica a trasmissione, o immagini TEM, ha rivelato che le vescicole extracellulari possedevano una morfologia circolare simile a una membrana.