Congelamento, lo scongelamento, e celle di imballaggio per il trasporto

Le colture cellulari sono utilizzate in un'ampia varietà di applicazioni di ricerca e diagnostiche. A volte è auspicabile conservare le linee cellulari per lavori futuri per preservare le cellule, evitare la senescenza, ridurre il rischio di contaminazione e minimizzare gli effetti della deriva genetica. Le linee cellulari possono essere congelate per la conservazione a lungo termine.

In questo video vi mostriamo come congelare le cellule cresciute sia in monostrato che in sospensione e come scongelarle per ricrescere. Ciao, sono Ricky qui al laboratorio del Dr.LAN presso la rete di laboratori di patologia molecolare nel Tennessee orientale. Oggi ti mostrerò come congelare le cellule per la conservazione a lungo termine e come scongelarle dall'azoto liquido.

Per congelare le cellule di aderenza umana, si inizia sollevandole dalla lastra come si farebbe se le si stesse impacchettando. Tieni presente che è meglio utilizzare cellule che si trovano nella loro fase logaritmica di crescita per la crioconservazione. Una volta che le cellule si sono staccate e hai fermato la reazione della tripsina aggiungendo siero o terreno contenente siero, trasferisci la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga sterile e aggiungi due mulini.

Il terreno completo con cellule di siero provenienti da tre o più piastre della stessa sottocoltura della stessa fonte può essere combinato in un'unica provetta. La centrifuga è costituita da celle per cinque minuti da 300 a 350 g a temperatura ambiente. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 10 mil di quattro gradi Celsius.

Completare il terreno, aggiungere un volume uguale di quattro gradi di mezzo di congelamento, mescolare accuratamente le cellule e quindi posizionare la provetta sulle celle di conteggio del ghiaccio. Utilizzando un emocitometro, diluire la sospensione con altro mezzo di congelamento per ottenere una concentrazione cellulare finale di 1 milione o 10 milioni di cellule per millilitro per congelare le cellule da un pallone quadrato di 25 centimetri quasi confluente. Resus sospendere in circa tre mil di mezzo di congelamento, pipettare un mil di aliquote di sospensione cellulare in fiale criogeniche da due mil etichettate.

Assicurarsi di stringere i tappi delle fiale. Mettere le fiale da un'ora a notte in un congelatore a meno 80, quindi trasferirle in un congelatore per la conservazione dell'azoto liquido. Il congelamento delle cellule da coltura in sospensione è simile in linea di principio al congelamento delle cellule da un monostrato.

La differenza principale è che le colture in sospensione non devono essere tritte. Inizialmente inizzato, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e centrifugare per 10 minuti a 300-350 Gs a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet a quattro gradi, congelando il mezzo a una densità compresa tra 1 milione e 10 milioni di cellule per mil.

Quindi trasferire un millimetro di aliquote di sospensione cellulare in fiale criogeniche e congelare. Come fatto per le colture monostrato, che è stato dimostrato nel capitolo precedente per scongelare e recuperare le fiale congelate. Per prima cosa, rimuovere la fiala di cellule dal congelatore ad azoto liquido e metterla immediatamente in un bagno d'acqua a 37 gradi.

Agitare continuamente la fiala fino a quando il mezzo non si è scongelato, operazione che generalmente richiede meno di 60 secondi. Una volta scongelata, pulire la parte superiore del flaconcino con etanolo al 70% prima di aprirlo. Quindi trasferire la sospensione di cellule di scongelamento in una provetta da centrifuga sterile contenente due mil di terreno completo caldo e il 20% di centrifuga di siero fetale bovino.

Questo per 10 minuti a 150-200 G a temperatura ambiente. Questa fase rimuoverà eventuali residui di DMSO dopo la centrifugazione, eliminerà il surnatante e sospenderà delicatamente il pellet cellulare in una piccola quantità di circa un mil di terreno completo e il 20% di FBS lo trasferirà in una piastra di coltura adeguatamente etichettata contenente la quantità appropriata di terreno. Generalmente, è necessario un mil di sospensione cellulare in 5-20 mil di terreno.

Ora puoi mettere le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius per farle crescere dopo 24 ore. Ti consigliamo di assicurarti che le cellule si siano attaccate alla piastra dopo cinque o sette giorni, o quando l'indicatore di pH nel terreno cambia colore, ti consigliamo di cambiare il terreno. Ti consigliamo di conservare le colture in un terreno contenente il 20% di FBS fino a quando la linea cellulare non si sarà ristabilita.

Se il tasso di recupero è estremamente basso, solo una sottopopolazione della cultura originale può essere in crescita. Prestare particolare attenzione a questo quando si lavora con linee cellulari note per essere mosaico. Se le colture devono essere spedite, questa operazione può essere eseguita facilmente sia per le colture monostrato che per quelle in sospensione.

Nella coltura tissutale di 25 centimetri, le cellule delle fiasche vengono coltivate fino a raggiungere una cofluenza vicina in un monostrato o a desiderare la densità in sospensione. Per le colture monostrato, il terreno viene prima rimosso e quindi il pallone viene riempito con terreno fresco. È essenziale che la staffa sia completamente riempita di terreno per evitare che le celle si secchino se le staffe vengono capovolte durante il trasporto.

Per la sospensione, le colture, fresco, il terreno viene aggiunto per riempire il pallone. Il tappo viene serrato e fissato in posizione con il profumo. Il pallone è sigillato in un sacchetto di plastica a tenuta stagna o in un altro contenitore a prova di perdite progettato per evitare fuoriuscite.

Nel caso in cui il pallone dovesse danneggiarsi, il contenitore primario viene quindi inserito in un contenitore secondario coibentato per proteggerlo dalle temperature estreme durante il trasporto. Un'etichetta di pericolo per l'acquirente è apposta all'esterno dell'imballaggio. Generalmente, le colture vengono trasportate nella stessa notte o durante la notte. Corrieri.

Ti abbiamo appena mostrato come congelare e scongelare le colture cellulari umane sia per le cellule aderenti che per quelle in sospensione. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con tutti i tuoi esperimenti.