Congelamento, lo scongelamento, e celle di imballaggio per il trasporto
2 luglio 2008
Coltura di cellule di mammifero sono ampiamente utilizzati negli studi di biologia cellulare. Questo video descrive le competenze di base necessarie per congelare e conservare cellule e come recuperare scorte congelate.
Le colture cellulari sono utilizzate in una vasta gamma di applicazioni di ricerca e diagnostica. A volte è utile conservare linee cellulari per lavori futuri, al fine di preservare le cellule, evitare la senescenza, ridurre il rischio di contaminazione e minimizzare gli effetti alla deriva genetica. Le linee cellulari possono essere congelate per la conservazione a lungo termine.
In questo video, ti mostriamo come congelare cellule coltivate sia in monostrato che in sospensione, e come scongelarle per farle crescere nuovamente. Ciao, sono Ricky, del laboratorio del Dr. LAN presso la Molecular Pathology Laboratories Network nell'East Tennessee. Oggi ti mostrerò come congelare le cellule per la conservazione a lungo termine e come scongelarle dall'azoto liquido.
Per congelare cellule aderenti umane, iniziare sollevandole dalla piastra come si farebbe in caso di confezionamento. Tenere presente che è preferibile utilizzare cellule in fase logaritmica di crescita per la criopreservazione. Una volta che le cellule si sono staccate e la reazione della tripsina è stata arrestata aggiungendo siero o mezzo contenente siero, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga sterile e aggiungere due millilitri.
Le cellule in mezzo completo con siero provenienti da tre o più piatti della stessa sottocoltura della stessa origine possono essere unite in un unico tubo. Centrifugare le cellule per cinque minuti a 300-350 ×g a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 10 mL a quattro gradi Celsius.
Mezzo completo, aggiungere un volume uguale di mezzo di congelamento a quattro gradi, mescolare accuratamente le cellule, quindi mettere il tubo sul ghiaccio e contare le cellule. Utilizzando un emocitometro, diluire la sospensione con ulteriore mezzo di congelamento per ottenere una concentrazione cellulare finale di 1 milione o 10 milioni di cellule per millilitro. Per congelare le cellule provenienti da una fiasca quadrata da 25 centimetri quasi confluenti, risospendere in circa tre millilitri di mezzo di congelamento e pipettare aliquote da un millilitro di sospensione cellulare in vial criogenici da due millilitri etichettati.
Assicurarsi di stringere bene i tappi sui vial. Collocare i vial da un'ora a tutta la notte in un congelatore a -80, quindi trasferirli in un congelatore a azoto liquido. Il congelamento di cellule da coltura in sospensione è simile, in linea di principio, al congelamento di cellule da un monostrato.
La differenza principale è che le colture in sospensione non devono essere trattate con tripsina. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga e centrifugare per 10 minuti a 300-350 ×g a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in mezzo di congelamento a quattro gradi, a una densità di 1 milione a 10 milioni di cellule per millilitro.
Successivamente, trasferire aliquote da un mil di sospensione cellulare in provette criogeniche e congelare. Come fatto per le colture a monolayer, che nel capitolo precedente è stato dimostrato per scongelare e recuperare le provette congelate. Per prima cosa, rimuovere la provetta delle cellule dal congelatore a azoto liquido e posizionarla immediatamente in un bagno d'acqua a 37 gradi.
Agitare continuamente il flaconcino fino a quando il mezzo non si sarà scongelato, il che richiede generalmente meno di 60 secondi. Una volta scongelato, pulire la parte superiore del flaconcino con etanolo al 70% prima di aprirlo. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare scongelata in un tubo da centrifuga sterile contenente due millilitri di mezzo completo caldo e siero fetale bovino al 20% da centrifugare.
Centrifugare per 10 minuti a 150-200 ×g a temperatura ambiente. Questo passaggio rimuoverà qualsiasi residuo di DMSO. Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in una piccola quantità, pari a circa un mil, di mezzo completo con 20% di FBS, quindi trasferire questa sospensione in una piastra per colture opportunamente etichettata contenente la quantità appropriata di mezzo. Generalmente, è necessario un mil di sospensione cellulare in cinque-venti mil di mezzo.
Ora, dopo 24 ore, è possibile coltivare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo cinque o sette giorni, o quando l'indicatore di pH nel mezzo di coltura cambia colore, verificare che le cellule si siano attaccate alla piastra e si dovrà sostituire il mezzo di coltura. Si dovrà mantenere le colture in un mezzo contenente il 20% di FBS fino al ripristino della linea cellulare.
Se la percentuale di recupero è estremamente bassa, potrebbe crescere solo una sottopopolazione della coltura originale. Prestare particolare attenzione a questo aspetto quando si lavora con linee cellulari note per essere mosaiche. Se le colture devono essere spedite, ciò può essere fatto facilmente sia per colture in monostrato che in sospensione.
In fiaschi da coltura tessutale da 25 centimetri, le cellule vengono cresciute fino a raggiungere una confluenza quasi completa in un monostrato o fino alla densità desiderata in sospensione. Per le colture in monostrato, il mezzo viene prima rimosso e poi il fiasco viene riempito con mezzo fresco. È essenziale che il fiasco sia completamente riempito di mezzo per evitare che le cellule si secchino nel caso in cui i fiaschi vengano capovolti durante il trasporto.
Per la sospensione, si aggiunge mezzo fresco alle colture per riempire il matraccio. Il tappo viene avvitato e fissato con del parafilm. Il matraccio viene sigillato in un sacchetto di plastica impermeabile o in un altro contenitore a prova di perdite progettato per prevenire fuoriuscite.
Nel caso in cui la fiasca dovesse subire danni, il contenitore primario viene quindi posto in un contenitore isolato secondario per proteggerlo da temperature estreme durante il trasporto. Un'etichetta di pericolo per l'acquirente viene applicata all'esterno del pacco. In genere, le colture vengono trasportate in nottata o entro la notte successiva. Corrieri.
Abbiamo appena mostrato come congelare e scongelare colture cellulari umane, sia per cellule aderenti che in sospensione. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con tutti i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo video illustra le tecniche essenziali per il congelamento e la conservazione di cellule di mammifero coltivate, nonché per il loro recupero da scorte congelate. Una corretta conservazione delle cellule è fondamentale per preservare le linee cellulari per future ricerche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Tecniche di coltura cellulare
- Conservazione delle cellule
Sfondo
- Le cellule di mammifero coltivate sono ampiamente utilizzate nella ricerca.
- Il congelamento delle cellule aiuta a evitare la senescenza e la contaminazione.
- La conservazione a lungo termine delle linee cellulari è essenziale per esperimenti futuri.
- Le tecniche di scongelamento sono necessarie per rivitalizzare le cellule congelate.
Scopo dello studio
- Illustrare il processo di congelamento delle cellule per la conservazione a lungo termine.
- Spiegare come scongelare le cellule congelate per la successiva crescita.
- Fornire competenze pratiche ai ricercatori che lavorano con colture cellulari.
Metodi Utilizzati
- Congelamento di cellule coltivate in monostrato e in sospensione.
- Utilizzo dell'azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
- Procedure di scongelamento per il recupero delle cellule congelate.
- Dimostrazione delle tecniche in un ambiente di laboratorio.
Risultati principali
- Congelamento e conservazione con successo di cellule di mammifero.
- Tecniche efficaci di scongelamento dimostrate.
- Conservazione della vitalità cellulare dopo lo scongelamento.
- Linee guida per evitare errori comuni nella conservazione delle cellule.
Conclusioni
- Le tecniche di congelamento e scongelamento sono fondamentali per il lavoro con colture cellulari.
- Metodi appropriati possono migliorare la longevità delle linee cellulari.
- Queste competenze sono essenziali per i ricercatori in biologia cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La conservazione e il recupero affidabili delle cellule sono fondamentali per mantenere modelli preclinici costanti e garantire la riproducibilità nelle fasi di validazione del bersaglio e nello sviluppo di saggi. Una corretta criopreservazione riduce al minimo la deriva genetica e i rischi di contaminazione, preservando l'integrità delle linee cellulari a lungo termine per la ricerca traslazionale. Queste tecniche permettono un approvvigionamento cellulare scalabile e standardizzato in tutte le fasi della scoperta e della sperimentazione preclinica, riducendo la variabilità negli studi meccanicistici e negli sforzi di identificazione dei composti promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente la conservazione di linee cellulari geneticamente stabili per un'analisi coerente dell'interazione con il bersaglio e dei percorsi biologici.
- Valore operativo: Riduce la necessità di subcolture frequenti, minimizzando la deriva fenotipica e la variabilità sperimentale.
Screening e sviluppo di saggi
- Valore scientifico: Fornisce ceppi cellulari a basso passaggio e rinnovabili per schermate ad alto rendimento e qualifiche di saggio riproducibili.
- Valore operativo: Garantisce coerenza tra diversi lotti nei saggi basati su cellule, migliorando l'affidabilità dei dati attraverso diverse campagne di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Garantisce la continuità dei modelli cellulari pertinenti alla malattia dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica.
- Valore operativo: Facilita la distribuzione standardizzata delle cellule tra team e siti diversi, sostenendo la collaborazione interfunzionale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La criopreservazione delle cellule si inserisce nel percorso della scoperta consentendo un approvvigionamento affidabile di cellule per la validazione degli obiettivi, lo sviluppo di saggi e i test preclinici, garantendo la coerenza del modello tra le diverse fasi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi fornendo linee cellulari stabili e ben caratterizzate per la validazione dei bersagli e l'elucidazione dei percorsi metabolici.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso scorte cellulari standardizzate e prive di contaminazioni, adatte per lo screening riproducibile di composti.
- Analisi: Genera input cellulari quantificabili e costanti che aumentano l'affidabilità dei risultati relativi alla risposta in funzione della dose e alla vitalità cellulare.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la fedeltà del modello dalla fase iniziale della scoperta fino agli studi preclinici, riducendo il rischio biologico nell' avanzamento dei composti promettenti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità centralizzata di banca cellulare riutilizzabile, che standardizza l'approvvigionamento cellulare tra progetti e aree geografiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta l'affidabilità predittiva riducendo alla minima espressione la deriva genetica e garantendo coerenza fenotipica nei saggi basati su cellule.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie a protocolli standardizzati per il congelamento, lo scongelamento e l'imballaggio.
- Valore strategico: Riduce il rischio di fallimento nelle fasi avanzate assicurando modelli preclinici affidabili e output biologici costanti.
- Impatto sul portafoglio: Permette decisioni basate sulla gestione del rischio fornendo sistemi cellulari affidabili per la validazione del bersaglio e l'ottimizzazione del composto leader.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso di tecniche asettiche e nella manipolazione di crioprotettori per mantenere la vitalità cellulare.
- Dipende dalla disponibilità di attrezzature per il congelamento a velocità controllata e di infrastrutture per lo stoccaggio in azoto liquido.
- Necessita di procedure operative standardizzate tra i diversi team per garantire tassi di recupero cellulari costanti.
- Richiede l'adattamento del mezzo di congelamento e della densità cellulare in base al tipo cellulare e alle caratteristiche di crescita.
- È limitato dalla sensibilità delle linee cellulari ai crioprotettori e allo stress da congelamento-scongelamento, che può influenzare l'efficienza di recupero.
