蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

サマリー

このビデオの記事では、良質の蛍光を達成するために精液のサンプルを処理する方法を順を追って、説明しますその場でハイブリダイゼーション。得られた製剤は、臨床診断のコンテキストで異数スクリーニングに用いることができる。

要約

Aneuploidiesは、ヒトで最も頻繁に染色体異常です。これらの異常のほとんどは、両親のgametogenic過程で減数分裂のエラーに起因する。人間の男性では、これらのエラーは、子孫にこれらの異常を送信するリスクの増加を表す数値染色体異常を持つ精子の生産につながることができます。

このような理由から、精子の核のin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光の技法は、広く臨床診断のコンテキストに組み込まプロトコルになっています。この練習では、遺伝的生殖アドバイスを求める患者の配偶子の数値染色体異常の頻度の推定値を提供します。

日付に、最も頻繁に精子のFISH分析に含まれる染色体は染色体X、Y、13、18および21です。

このビデオの記事は、順を追って説明し、人間の精液のサンプルを処理し、解決する方法、精子のクロマチンをdecondenseと変性する方法、どのように精子FISHの準備を取得するために進むために、そして顕微鏡での結果を可視化する方法。最も関連性の高い手順の特記事項は、最高の結果を達成するために与えられている。

プロトコル

I.サンプルの処理および細胞の固定

1. 液状化するまで、室温で20分間滅菌した容器に精液のサンプルのままにしておきます。
2. 遠心チューブに試料を移し、5分間千グラムで、それを回転させる。
3. 静かにパスツールピペットを用いて上清を除去して捨てる。
4. 10mlの最終容量を得るためにボルテックスで混合しながら、低張液（塩化カリウム、0.075M）37予備加熱° C、滴ずつ、追加してください。
5. 37水浴中にチューブを置きます℃で30分間。
6. 5分間千グラム間遠心する。慎重にペレットを乱すことなく、デカンテーションで上澄み液を捨てる。
7. 8ミリリットルの最終的な音量を得るためにボルテックスで混合しながら滴ずつ：ペレットを再懸濁させた後、作りたてのカルノア固定液（酢酸3時01メタノールの）追加。
8. ホワイトペレットを得るために必要な回数だけポイント6と7を繰り返します。
9. 作りたてのメタノール追加：酢酸（3:1）（小さなペレットとそのような場合で広がり良好な細胞を得るために必要な細胞濃度に最終的な音量を調整するために滴ずつを、数滴は高い金額でのサンプルに対し、十分になります回収した精子から、最後のボリュームは）1-2 mlを達することができる。テストスライドは、油を塗っていないスライドに再懸濁したサンプルを滴下し、位相差顕微鏡下でそれを調べることによって行うことができます。これは、得られた細胞の分散をチェックし、必要に応じて、さらにスライドで、、それを訂正できるようになるようになる。
10. 拡張子を、40cmの高さの最小値からドロップunfrostedのスライドの中央に細胞懸濁液の二、三滴（以前に、それらを脱脂するために-20℃でメタノールに保存されている）。を作るためにプロトコル全体にサンプルの場所を有効にするには、ダイヤモンドの鉛筆を使ってスライドの反対側の精子の拡張子を含む領域をマーク。
11. 少なくとも24時間、-20 ° Cでスライドを保存する。
    注意：メタノールの添加：酢酸（3:1）滴ずつ混合が精子凝集体の形成を避けるために非常に重要なステップですが。

II。脱凝縮

1. スライドは、-20℃で保存は、（室温でそれらを残す）プロトコルを続行するために解凍する必要があります。
2. 3分ごとに2倍の生理食塩水、クエン酸ナトリウム溶液（2xSSC）の2つの連続した​​コプリンジャーにスライドを配置。
3. 各コプリンジャーで2分間エタノール洗浄の一連のスライドを転送する。 70％エタノールで開始、100％で90％、仕上げによって従ってください。室温でそれを残してスライドを乾燥させます。
4. 37℃でジチオスレイトール溶液中でスライド（1,4 - ジチオスレイトール5mmの1％トリトンX - 100、2 - アミノ-2 - （ヒドロキシメチル）-1,3 - プロパンジオール50mmのを）インキュベートしますインキュベーターでCは、クロマチンをdecondenseする。この製品は、精子核のプロタミンのジスルフィド架橋そのコイルDNAを破壊することによって動作します。精子核のDNAは高度に圧縮されるので、これは非常に重要なステップです。ジチオスレイトール溶液（DTT）のスライドのインキュベーション時間は、この製品に対するサンプルの反応性に応じて調整する必要があります。それは2〜15分ごとに異なる​​ことができますが、通常、この時間は、8分程度です。
5. すぐに、各コプリンで3分間2xSSC二つの連続した​​コプリンジャーにスライドを転送する。
6. 各コプリンジャー（70％、90％および100％エタノール）で2分間エタノール洗浄の一連のスライドを配置することによって継続する。スライドを室温で乾燥させて。
   注：あまりにも短い露光には、いくつかのシグナルの欠如につながるだろう、一方DTTに過度の暴露は、手順の最後にFISHシグナルを分散させるという結果に。

III。交配

1. 73行でホルムアミド溶液（70％Formamide/2xSSC）℃で5分間でコプリンジャーにスライドをインキュベートすることにより、精子のDNAを変性させる。
2. コプリンジャー当たり1分（70％エタノールで85％を開始し、100％で終了）のためにエタノール溶液を介してスライドを転送する。室温で乾燥させるスライドにしておきます。
3. の直接5リットルを追加し、対応するすぐに使用できる15x15カバースリップ（AneuVysionアッセイマルチカラープローブパネル：CEP 18/X/YまたはLSI 21分の13）にプローブの混合物を。
4. それはビデオに示されているように、慎重に標的領域とプローブの混合物をまとめるためにカバースリップの上にスライドを配置。ラバーセメントでそれを封印。
5. 予め温めておいた37にスライドを配置° Cハイブリダイゼーションチャンバー（HYBrite™）および6〜24時間37℃で反応させる。
   注：精子のサンプルの変性が必須であるのに対し、プローブを変性の必要性は、製造業者によって決定されます。このプロトコルで使用されるプローブの混合物は、使用する準備ができていると、このケースでは、プローブの変性は不要です。
   プローブの混合物の体積は、ハイブリダイズした領域のサイズに応じて異なります。

IV。洗浄ポストハイブリダイゼーション

1. ハイブリダイゼーションチャンバーからスライドを取り出してください。
2. ラバーセメントを取り外し、慎重に側に静かにスライドカバースリップを引き出します。
3. 排除する非特異的ハイブリダイゼーションシグナルは、NP - 40は73で予め温めておいた0.4xSSC/0.3％でコプリンジャーに2分間、スライドを配置℃の水浴でC。
4. 2xSSC/0.1％のNP - 40 1分間室温で洗浄溶液にスライドを移し。スライドを室温で乾燥させて。
5. ターゲット領域（18 × 18カバースリップ用8リットル）に対比製品を追加。使用される最も一般的な製品は、4'、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI、バイシス社）です。
6. それはビデオに示されているように、カバーガラス（カバーガラスをマニキュアで密封することができるハイブリダイゼーションを維持するために）とハイブリダイズした領域をカバーする。
7. 彼らの見通しの分析まで暗所で-20℃でハイブリダイズしたスライドを保存する。これらの条件下でのスライドは、蛍光シグナルの強度を大幅に失われることなく、12ヶ月間まで保存できます。
   注：反対は、非特異的プローブのハイブリダイゼーションを洗い流すだろうに対し、より高い温度または過度の洗浄時間は、いくつかの信号の除去をもたらすことができる。
   追加された対比製品の体積がカバーするハイブリダイゼーション領域のサイズに応じて異なります。

V.の可視化

準備はDAPI /テキサスレッド/ FITCとシングルバンドアクア、FITCおよびテキサスレッドのためのフィルタのためのトリプルバンドフィルターを備えた蛍光顕微鏡下で評価することができます。標準の評価基準は、精子の核¹の正しい評価のために従う必要があります。

染色体X、Y、18用のプローブとハイブリダイズする準備は、これら3つの染色体のための信号が表示されます。すべての正常な精子一青の信号（18番染色体に相当する）、そして緑の信号（X -ベアリングの精子）や赤の信号（Y -ベアリング精子を）示す必要があります。

染色体13および21、13番染色体と21番染色体は赤色信号のための緑の信号のためのプローブとハイブリダイズする準備のためにすべての通常の精子に区別されなければなりません。

ディスカッション

このプロトコルは、精子のFISHの準備を取得するために人間の精液のサンプルを処理する方法について説明します。それがこのプロトコルを使用すると、雄の配偶子の染色体異常を分析することが可能です。精子異数性のスクリーニングは、基礎研究の文脈でと不妊男性に与えられた生殖アドバイスのいずれかのアプリケーションを持っています。臨床診断に最も広く研究されている染色体はX、Y、13、18と21ですが、染色体と遺伝子座の広い範囲の他の市販のプローブが使用可能であり、またこれらの実験で使用することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1,4-ジチオスレイトール (DTT)	材料	ロシュ・グループ	10197777001
2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール	材料	ロシュグループ	10708976001
酢酸	材料	Merck &株式会社	100.063
AneuVysion® マルチカラーDNAプローブキット <リチウム>20倍塩化ナトリウム-クエン酸ナトリウム緩衝液 4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI II) <リスト項目>CEP 18/X/Y DNAプローブ<リチウム>NP-40<リチウム>LSI 13/21 DNAプローブ	材料	Vysis Inc.	32-161075 <リチウム>30-805850 30-804941 <リチウム>30-171077 30-804820 30-171078
遠心分離機 5804R	ツール	Eppendorf
遠心チューブ	材料	Nalge Nunc international	347856
コプリンジャー（ガラス製）	材料	Barloworld Scientific	Hellendahl (ZCT278)
コプリンジャー（プラスチック製）	材料	Deltalab	191087
カバーガラス (15x15)	材料	Knittel Glaser	4600115
カバーガラス (18x18)	材料	クニッテル・グレイザー	4600118
ダイヤモンドペンシル	材料	ハマッシャー	335117010
エタノール	材料	Merck &株式会社	100.983
ホルムアミド	材料	ロシュグループ	11814320001
冷凍庫	ツール	Zanussi
手袋	材料	三洋	101/3300
HYBrite™	ツール	Vysis Inc.
浸油	材料	オリンパス株式会社	35505
インキュベーター	ツール	Heraeus Instruments
メタノール	材料	Merck &株式会社	106.009
マイクロピペット	材料	ラボシステム	フィンピペット (4500000)
マイクロピペット交換用チップ	材料	Daslab	16-2001
ネイルラッカー	材料	クオ・コスメティクス
Olympus BX60落射蛍光顕微鏡	ツール	オリンパス株式会社		DAPI/Texas Red/FITC用の3波長フィルター、およびAqua、FITC、Texas Red用の単波長フィルターを搭載しています。
パステールピペット	材料	Rubilabor	211.0230
位相差顕微鏡	ツール	ニコン製機器
プラスチックピペット (3ml)	材料	Deltalab	200007
塩化カリウム (KCl)	材料	Fluka	60128
ラバーセメント	材料	最良テスト
スライド	材料	Knittel Glaser	4520022
スライド保存ボックス	材料	Deltalab	19276.1
滅菌容器	材料	Deltalab	409726
シリンジ	材料	PentaFerte	002022300
温度計	材料	Comark Instruments, Inc	KM12
三回蒸留水	材料
Triton X-100	材料	Sigma-Aldrich	9002-93-1
ピンセット	材料	B. Braun Medical	Aesculap (BD224R)
垂直層流 <電子顕微鏡>クリーンベンチ	ツール	ブルディノラ	OR-ST 1500
ボルテックスミキサー	ツール	Fisher Scientific	FB15012
恒温水槽	ツール	Raypa®