ここでは、幼虫および成体から心臓管の様々な要素の蛍光標識するための基本的なプロトコルを記述するキイロショウジョウバエ。これらの標本は、蛍光または共焦点顕微鏡を介して画像処理に適しています。この手法は、強力なモデル生物からの心の機能の詳細な構造解析を可能にします。
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この記事について
サマリー
プロトコル
あなたが始める前に
- 以下のソリューションを準備します。
- リラックスバッファー（10 mM EGTAを含む人工的なショウジョウバエの体液（ADH）（" ショウジョウバエの心臓の鼓動を可視化する"を参照））
- 固定液（1 × PBS中4％ホルムアルデヒド）
- PBSTx（PBS、0.1％トリトン- X - 100を含む）
- PBSTxで適切に希釈した一次および種特異的蛍光標識二次抗体
- 心臓の管（大人ハエおよび/ または幼虫の）次のことを公開するショウジョウバエを解剖する
- " ショウジョウバエの心臓の鼓動を可視化"のセミ無傷ショウジョウバエの心臓標本のプロトコル、または
- 次の変更とショウジョウバエの幼虫NMJ解剖プロトコル 1：使用すると、幼虫の解剖時にADHを酸素化し、腹側正中線から少し後ピンに置き換える。幼虫は腹側正中線に沿って切断されています。固定前に任意の組織を削除しないでください。
蛍光染色
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ディスカッション
ここでは、 キイロショウジョウバエの背の容器と蛍光または共焦点顕微鏡を介してイメージングのための関連する組織を準備し、染色のための有用なプロトコルを提示。私達はによって洗練されたと一般的に幼虫と成体ショウジョウバエの心臓管の in situイメージングでよく解決を可能にする効果的な染色のために私たちの研究室で用いられる手順の簡潔なアカウントを提供しています。その他は、省略形2、3、4に類似した方法を記載している。
染色の手順を実装する際に重要な追加の詳細は、考慮が必要です。例えば、他の生体物質に見られるように、かなり準拠してショウジョウバエの心臓の筋線維は非常に脆く、以下の固定となる。特に注記のうち5かなり繊細な心管に取り付けられた支持翼の繊維、、6、7の複数のペアがあります。従って、不要な操作を制限することが物理的なストレスや固定組織に直接損傷を減少させ、保存状態の良い、完全に無傷の構造を視覚化する可能性が高くなります。さらに.......
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謝辞
著者は、この原稿の準備に関する重要な読書と有益な提案のためにSIバーンスタイン（サンディエゴ州立大学）を感謝。この作品は、SIバーンスタイン、SDSU、へとR. Bodmer、BIMRにNIHの補助金によって支えられて、とアメリカ心臓協会の西部米国アフィリエイトからG.フォーグラーへとA. Cammaratoにポストドクトラルフェローシップによる。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N’,N’-テトラ酢酸 (EGTA) | 試薬 | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| ホルムアルデヒド、10%、メタノールフリー、Ultra Pure | 試薬 | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | 試薬 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 ファロイジン | 試薬 | Invitrogen | A12381 | |
| Vectashield® DAPI含有蛍光用封入剤 | 試薬 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| タングステンピン | 試薬 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| ピンホルダー | 試薬 | Fine Science Tools | 26018-17 |
参考文献
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
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再版と許可
