γH2AX巣に基づいてDNA二本鎖切断の定量は、組織の放射線感受性と放射線修正する化合物の作用の評価に、特に放射線の生物学では、非常に貴重なツールとなっています。ここでは、組織サンプルにおけるγH2AX病巣の定量のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
DNA二本鎖切断（DSB）は、内因性（生理学的または病理学的）プロセスによって、または外因性の因子、特に電離放射線と放射線作用の化合物のいずれかによって発生する可能性、特に致命的と遺伝毒性病変、です。セリン- 139残基が、高度に保存されたC末端SQEYのモチーフで、γH2AXを形成し、DNA二本鎖切断に早い応答であるにH2Aヒストンバリアント、H2AXのリン酸化
プロトコル
組織
- 最適な切削温度（OCT）コンパウンド4583で金型に組み込まれた肺組織は、、CMライカ1950クライオスタットを用いて、ポリ- L -リジンスライド上にマウントされている（5μm）を切片であった。
凍結サンプルは、マードック児童研究所で博士サイモンロールスロイスから得られた。肺組織は、未処理のBalb / cマウス由来とヒトの喘息6の病理学的特徴の多くを示す慢性アレルギー性気道疾患のマウスモデルから得られた。動物実験は科学的な目的のために実験動物の管理と利用の実践のためのオーストラリアのコードに準拠しているマードック児童研究所の動物倫理委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
- セクションは、1時間室温で風乾させた。
免疫蛍光染色
- セクションは、2％（w / v）のリン酸のパラホルムアルデヒドで20分間緩衝生理食塩水（PBS）で固定した。
- のセクションでは、15分ごとにPBSで2回洗浄と平衡化した。
- セクションは10分ごとに、PBSで3回洗浄した20分間70％エタノール（-20℃に冷却）で処理した。
この時点で、スライドは最大2週間まで4℃で密閉容器で保存することができる。
- セクションは10分ごとに、PBSで3回洗浄し、次いで新鮮PBS含む0.5％のTween - 20及び0.1％トリトンX - 100室温で1時間（PBS - TT）の8％BSAを含むPBSで調製された100μLでブロックされた。
すべてのインキュベーションは加湿染色トラフで実施した。 - セクションは、5分間PBS - TTで洗浄し、疎水性の境界は、パパニコロウペンを持つ組織の周囲にマークされました。
- 過剰なバッファがオフチップを渡したされ、一次ウサギポリクローナル抗γH2AX抗体（PBS中の1％BSAで、1:500に希釈し、ミリポア）100μlのは、室温で2時間のインキュベーションのために各セクションに追加されました。
一次抗体とのインキュベーションを4℃で一晩実施されることがあります
さらなる証拠を、γH2AX病巣がDSBのを表していること、DSBの修復のタンパク質を認識する一次抗体を使用してもよい。例えば、γH2AXとリン酸化ATMの共局在は、一般的に使用される組み合わせです。 - 暗所で室温で1時間、セクションが各5分間PBS - TTで2回洗浄し、二次抗体液100μl（Invitrogen社のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgGを1％BSAで、1:500に希釈）とともにインキュベートした。 （希釈した抗体は、プロシージャ全体で暗所で保管された）。
- セクションは、各5分間PBS - TTで3回洗浄し、37℃で30分のため0.5mg/mL RNアーゼA℃でインキュベートした。
- 対比と取り付けの核はヨウ化プロピジウムを含むVectashieldの培地で行った。
- スライドはマニキュアで密封し、℃の暗所での分析の前に4℃で一晩保存した。
顕微鏡/分析
- （ - のAlexa Fluor ® 488ヤギ抗ウサギIgGγH2AXのため）とPI（543 nm）のレーザーツァイスLSM510のメタ共焦点顕微鏡は、標準的なGFPを使用して画像を取得するために使用されていました。
画像は、0.5μmのステップサイズとZシリーズのパターンで獲得されました。分析中に、個々の面は、デコンボリューションと巣の重複を最小限に抑えるために最大限の投影画像を生成するために積層した。
前の粒子数の最大値投影画像を作成する方法は、薄切片（例えば、5μm以下）を使用し、バックグラウンド染色はわずかですどこにされる状況でのみ使用する必要があります。ここで、重要なバックグラウンドを持つ厚いセクションがBolteとCordelieresで説明されているように、このような3Dオブジェクトカウンタなど、より複雑な分析を分析する必要があります（2006年）7を使用する必要があります。
- Metamorph（Molecular Devices社、米国）は、病巣の数を定量するためにマージ（赤と緑）の画像を作成するために使用されました。
Metamorphが巣の数を定量化するために使用できますが、組織切片を使用して、通常、時病巣は、より高い精度のために（目で）手動でカウントされます。
興味の特定の細胞型は、インスタンスの肺上皮細胞のために、定量用に選択することができます。これは、組織学上及びヘマトキシリン及びエオシン染色連続切片への参照を持つ基づいて行われることがあります。
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ディスカッション
このデモンストレーションの目的のために我々は、未処理のBalb / cマウスからと慢性アレルギー性気道疾患のマウスモデルからマウスの肺組織を使用する。我々は、未処理のセクションに比べて損傷した肺で観察されたわずかに高い平均で細胞あたりの巣の数の違いを定量。特に、定量はそれぞれ、未処理組織と慢性アレルギー性気道疾患の組織で、/セルあたり6.5巣および/セルあたり9.4巣（セクションあたり20細胞の手動カウント）を示した。しかし、DSB誘発剤の使用は、マウスの肺モデルにおいてDSBのを誘導することが知られている例のナフタレン、のために、より高い病巣の番号を生み出しています。確かに、このプロトコルは、ほとんどの組織での電離放射線の影響の調査に適しています;γH2AX巣数と解像度の点でより顕著な結果は、電離放射線が使用されているときに得られる。これはよくX線への暴露は、急速にγH2AX巣の形と病巣の番号は30〜60分2との間で最大に達することが知られている。したがって、1時間の時点（照射後）は、初期のDSBの形成とDNA修復を監視するために使用することができる長い時間（通常は最大48時間）の評価に最適です。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。 LMは、メルボルン研究所（メルボルン大学）と医学のCRCの補助金によってサポートされています。モナッシュマイクロイメージング（博士スティーブンコーディとISKAカーマイケル）のサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。 MMTは、国立衛生研究所から博士オルガSedelnikovaから専門家の援助とアドバイスに感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | 非特異的な抗体結合をブロックするために、BSA (1%) を使用します。一次抗体および二次抗体はBSAで希釈します。 | |
| PBS（Ca不含）2+ およびMg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| OCT（最適凍結切片用）コンパウンド 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | ポリリシンコートスライド | メンゼル-グレーザー | SF41296SP | 凍結組織切片を静電的に吸引し、追加のコーティング剤や接着剤の必要性を低減します。 |
| Tween 20 | 試薬 | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%)は、細胞を透過させるための界面活性剤である。 |
| Triton X-100 | 試薬 | Sigma-Aldrich | T8787 | 細胞を透過させるため、Triton X-100 (0.1%) を使用した。 |
| パラホルムアルデヒド | 試薬 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 抗リン酸化-γH2AX（ウサギポリクローナル抗体） | 一次抗体 | Upstate, Millipore | 07-164 | 一次抗体の希釈（1:500）、1% BSA中。 |
| Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) | 二次抗体 | Invitrogen | A-11008 | 二次抗体の希釈（1:500）、1% BSA含有溶液にて。 |
| エタノール (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNase A | 試薬 | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | 試薬 | Vector Laboratories | H-1300 | プロピジウムヨード（赤色核染色剤）を含むグリセロールベースの封入剤。この封入剤は、屈折率が一致するオイル浸漬レンズと共に使用する必要がある。 <組織 OCT（最適切断温度）化合物 4583のモールドに包埋した肺組織を、CM Leica 1950クライオスタットを用いて切断（5 μm）し、ポリL-リシン処理スライドに貼付した。凍結サンプルは、Murdoch Children's Research InstituteのSimon Royce博士より提供を受けた。肺組織は、未処理のBalb/cマウス、およびヒト喘息の多くの病理学的特徴を示す慢性アレルギー性気道疾患マウスモデルから採取した。動物実験は、科学的目的のための実験動物のケアおよび使用に関するオーストラリア行動規範を遵守するMurdoch Children's Research Instituteの動物倫理委員会のガイドラインおよび規定に従って実施した。切片を室温で1時間自然乾燥させた。 免疫蛍光染色 切片を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の2% (w/v) パラホルムアルデヒドで20分間固定した。PBSで15分間の洗浄を2回行い、切片を平衡化した。切片を-20°Cに冷却した70%エタノールで20分間処理し、続いてPBSで10分間の洗浄を3回行った。この時点で、スライドを密封容器に入れ、4°Cで最大2週間保存することが可能である。切片をPBSで10分間の洗浄を3回行い、その後、0.5% Tween-20および0.1% Triton X-100を含むPBS（PBS-TT）に調製した8% BSAを含むPBS 100μLを用いて、室温で1時間ブロッキングした。すべてのインキュベーションは、加湿された染色槽内で行った。切片をPBS-TTで5分間洗浄し、Pap penを用いて組織の周囲に疎水性の外周をマークした。過剰なバッファーを捨て、一次抗体であるウサギ抗γH2AXポリクローナル抗体（1% BSA含有PBSで1:500に希釈；Millipore）100μLを各切片に加え、室温で2時間インキュベートした。一次抗体によるインキュベーションは、4°Cで一晩行うことも可能である。γH2AXフォーカスが二本鎖切断（DSB）であることをさらに証明するために、DSB修復タンパク質を認識する一次抗体を使用してもよい。例えば、γH2AXとリン酸化ATMの共局在化は一般的に用いられる組み合わせである。切片をPBS-TTで5分間の洗浄を2回行い、二次抗体（Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGを1% BSAで1:500に希釈；Invitrogen）100μLとともに、室温・暗所にて1時間インキュベートした（希釈した抗体は、手順全体を通して暗所で保管した）。切片をPBS-TTで5分間の洗浄を3回行い、0.5mg/mL RNAse Aで37°C、30分間インキュベートした。核の対比染色および封入は、プロピジウムヨードを含むVectashield mediumを用いて行った。スライドをマニキュアで密封し、解析前に4°Cの暗所で一晩保存した。 顕微鏡観察／解析 Zeiss LSM510 Meta共焦点顕微鏡を用い、標準的なGFP（γH2AX - Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG用）およびPI（543 nm）レーザーを用いて画像を取得した。画像は、ステップサイズ0.5 μmのZシリーズパターンで取得した。解析では、個々の平面をデコンボリューションしてスタックし、フォーカスの重なりを最小限に抑えるために最大投影画像（maximum projected image）を作成した。粒子カウント前に最大投影画像を作成する方法は、薄い切片（例：5μm）を使用し、かつ背景染色の影響が無視できる場合にのみ使用すべきである。背景が顕著な厚い切片を解析する必要がある場合は、BolteおよびCordelieres（2006）によって記述されている3D Object Counterなどのより複雑な解析法を用いるべきである。フォーカス数の定量化のためのマージ画像（赤および緑）の作成には、Metamorph (Molecular Devices, USA) を使用した。Metamorphを用いてフォーカス数を定量化できるが、通常、組織切片を用いる場合は、より高い精度を得るために目視でフォーカス数をカウントする。肺上皮細胞など、目的とする特定の細胞型を選択して定量化することも可能である。これは、組織学的特徴に基づき、ヘマトキシリン・エオジン染色した連続切片を参照して行うことができる。>注：一般的に使用されるDNA染色剤：4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド（DAPI）。適切な励起レーザーを備えた顕微鏡でのみ使用可能。 |
| ミニPAPペン | Invitrogen | 008877 | ||
| カバーガラス (22x50mm) | メンゼル・グレイザー | CS2250100 | ||
| コプリンジャー、ガラス製 | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| 染色槽 | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta 共焦点顕微鏡 | 共焦点顕微鏡 | |||
| CM Leica 1950クライオスタット | ライカ マイクロシステムズ | |||
| Metamorph | 画像解析用ソフトウェア | Molecular Devices |
参考文献
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
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