ここでは、ステンドグラスの取り付けプロトコルを提示ショウジョウバエ共焦点顕微鏡を用いて断面のイメージングを可能にする直立姿勢における胚。
この記事について
サマリー
要約
いくつかのよく知られた形態形成の勾配と細胞の動きが背/腹軸に沿って起こる
プロトコル
1。イメージング手法
- それが均一に液体になるまで20〜30分55℃程度の水浴中にゼリーグリセリンを溶かす。渦巻が、気泡の形成を避けるために、ボトルを振っていない。
- ゼリーが溶けている間、きれいなガラススライド（オプション）にキムワイプを用いてグリセロールの薄層を適用する。
- 薄い最初のレイヤーを作成するスライドの表面上にカットP1000ピペットチップを使用してゼリー溶けたグリセリンのピペット1から1.5 mLの。泡を避けるために慎重にピペット。
- ゼリーは、水平面上で5分間、その後5分間-20℃でスライドを配置し、胚の整列に進みます固化してみましょう。また、サランラップでスライドをカバーし、最大5日間4℃に置きます。
- ゼリーの寝具の側に70％グリセロール/ PBSまたは他の退色グリセロールベースマウントメディア（例えばSlowfadeまたはVectashield）で染色した胚の小滴をピペット。
- 個別にゼリーの表面にドロップダウンリストから、それらを転送することによって胚を事前に合わせ始める。スプーンのように傾斜した面を使用して、斜めの皮下注射針を使用してそれらを転送します。
- およそ2から3列に沿って胚を置く。胚を針に陥っている場合、それを解放するために、他の胚を含むドロップダウンでそれをかき混ぜる。慎重にこの時点でそれらを合わせて時間を無駄にしないでください。列の間にスペースを残す。
- 皮下注射針の助けを借りて、ゼリーの培地上に水平にスライドするだけで胚の位置を合わせます。一方、スライド、向きが同じ方向に頭と尾。列に沿って互いにそれらを平行にしてください。ツイストペアKimiwipeの切れ端で証跡として残すPBSのグリセロールの過剰を削除します。
注：過剰なグリセロールは難しいカットしてマウントすること、二つのゼリー層の分離の結果、胚がゲル内に緩く包むべきものになります。逆に、あまりにも多くのグリセロールを削除すると、乾燥や胚を平らになります。 - 胚（50〜150μL、整列された数に応じて）上のゼリーの薄層を広げるためにカット黄色の先端を使用してください。
- 場所の10〜20分間、-20℃の冷凍庫でスライドまたは4℃で一晩保管してください。ゼリーはカットする前に完全に剛性であることを確認します。それ以外の場合、胚のブロックは、物品税が非常に困難になります。最先端で最良の結果は、次の日に取得されます。
- 解剖スコープで、整列胚の両側にゼリーを介して完全にカットするためにカミソリの刃を使用してください。ストレートカットを作るために90 °の角度でカミソリの刃を保持する。カットは、撮影の妨げになる余分なゼリーを避けるために、胚の前部と後部の極に非常に近いなされるべきである。
- カットの隣に冷たいPBT 100〜200μL（4℃、PBS +0.1％Tween20を）追加し、慎重にスパチュラを用いて胚の間にゼリーを削り取る。
注：PBTの洗剤は、胚を損傷することなく、スライドからゼリーの除去に役立ちます。 - 針を使用して、さらに加工するためのクリーンなスライドに埋め込まれた胚とゼリーのブロックを転送する。 5月7日胚で小さなブロックをカット。簡単にゼリーのブロックを移動するPBTを使用してください。また、それは必要に応じて正確に、ゼリーをトリミングするための、より安定性を作成するガラス、に接続できるように乾燥したガラスの表面にブロックを設置。
- かみそりの刃と針の助けを借りてゼリーに埋め込まれた直立胚を反転します。顕微鏡下で可視化のために、使用されているスタンド顕微鏡の種類に応じて、以下の2つの手順のいずれかに進みます。
- 倒立顕微鏡：場所は直立の位置に胚を、長いカバースリップの上に胚のブロックを終了する。ゼリーの最低額と胚の側は客観的との緊密な接触になることを確認してください。
- 正立顕微鏡："サポートする"として使用されると、"サポートする"との間にグリセロールの胚のブロックを配置するために瞬間接着剤で接着4本の＃1カバーグラスで2つのスタックを作る。長いカバースリップを使用してスタックを埋める。
- 共焦点分析のために、あなたが画像のすべての方法を胚を介して、または部分的にしか処理できるかどうかを調べるために使用される目的の作動距離を確認してください。たとえば、D.キイロ胚の長さは〜0.55 mmを持っていると完全にツァイス20倍プランアポまたは40倍LDネオフルーアの対物レンズを用いて画像化することができます。次のWebサイトは、利用可能なツァイスの目標に関する情報を持って、あなたの作動距離に応じて目標を検索するオプションを与える：https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.phpを
2。代表的な結果
胚はそのまま残っているので、この方法は、胚のサイズと遺伝子発現パターン間の距離の正確な測定を行うために使用することができます。図1では、我々は核 染色DAPI（青）、抗背タンパク質（赤）、SOGのmRNA（黄色）とSNAのmRNA（緑）で染色した胚盤葉期胚を示しています。形態学的プロセッSES、中胚葉の陥入（図2A、B）と中胚葉細胞（図3と4）の移行などもこの方法を使用して視覚化することができます。 DVの軸に沿って異なるZ -位置は、図2-4に示すように、焦点面を変更することにより得ることができます。
図1。胚盤葉の段階で無傷の胚の直立光学スライス。mRNAとタンパク質のための二重染色。 situプローブの（SOGとSNA）と一次抗体（抗背側）で染色したタンパク質の標的mRNAは、図に示されている。 DAPIは核を標識するために使用されていました。背の発現は核でありながら、SOGとSNAの発現は、細胞質内にapically配置されていることに注意してください。核に位置してSOGの新生転写物からの強い信号はまた、この倍率で見ることができます。
図2。無傷gastrulating胚の直立像。mRNAのプローブは、使用されており、それぞれの色が図に示されている。 A）、（SNA、緑のSOGとDPP、）、、この段階では同じフッ素で染色された3つの遺伝子を注意して空間的に分離されたドメインで表されます。 invaginating中胚葉は、SNAを表現する、神経芽細胞層はINDを表現し、SOGの表現はまだ神経系の腹側の領域に存在している間、外胚葉は、DPPを表現しています。 B）同じ胚の深い焦点面では、我々は強くSNAを表現invaginating中胚葉の基底に注意してください、しかし、その先端部は、低いレベルを表している。
図3。 。 カタツムリ、INDとDPPのmRNA（緑）、背側蛋白質（赤）、 胚芽のバンドとそのまま胚の直立像は、SOG RNA（黄色）を拡張 。核はDAPI（青）で染色した。胚の頭部に近いA）フォーカルプレーン。同じ胚のトランクの地域でのB）もう一つの焦点面。横方向の移行が（図4を比較）の胚帯の拡張胚の両側に腹側正中線に近い嘘前に中胚葉細胞の質量に注意してください。剥離神経芽細胞は、緑色（INDおよびSNA）のラベルが付いています。
図4。胚帯の拡張時に無傷の胚の直立像 SOG RNA（黄色）、。 カタツムリ、INDとDPPのmRNA（緑）、背側蛋白質（赤）。 A）上皮（矢印）から剥離神経芽細胞（注）、（緑）この段階ではINDとSNAの両方を染色した。 SOGの制限された発現は腹側正中（黄色）にも注意してください。この段階でDPPの発現は、胚の側面（アスタリスク）で見ることができます。 B）同じ胚の光学セクションでは、半ば後方部に相当する胚の長さ、の終わり近くに示します。腹側正中の細胞は、SOGのために染色されています。
ディスカッション
それは、スライス2または通常蛍光stainingsに対して有害であるミクロトーム処理、ために埋め込 まれたメディアの使用のいずれかの慎重な手の郭清を必要とするので、 ショウジョウバエの胚の断面の画像を取ることは、挑戦することができます。また、共焦点顕微鏡で作られたZ -スタックは、断面の画像の3D再構成を作るために使用することができます。しかし、正確な三次元再構成と光退色問題のあるなるためにいくつかの薄い共焦点スライスを作るために時間がかかるがそれです。縦にマウントされているイメージング胚もタンパク質またはmRNA発現レベル1の定量化を目的と蛍光シグナルの正確な測定を行う複雑胚の深いセクションに到達したときに発生する光の散乱であるもう一つの懸念。たとえ2光子共焦点顕微鏡で、光散乱はまだ限られるため、サンプルの最適な透明性のためにマウントメディアの選択を行った胚の真ん中に卵黄物質の不透明度、に起因する問題です。
これらの問題を回避するために、垂直に位置決め胚のイメージング"に関するエンド"と呼ばれる新しい技術は、最近、画像の両方のライブと固定試料4に開発されました。本稿では、 その場プローブ3 で複数で汚れている任意のサイズと形状の固定された胚や組織の簡単な準備と可視化を可能にする縦置きでマウント胚のための新しいプロトコルを開発しました。我々の手法は、その中に整列胚を包むために使用されるゼラチン状の一貫性と取り付けメディアを使用して構成されています。埋め込まれた胚を含むこのマウントメディアのカットブロックは共焦点顕微鏡、任意のタイプのイメージングの前に直立に配置することができます。
ゼリーに胚を埋め込むと垂直に配置することによって、我々は、胚の背腹軸に沿って細胞が同時に記載されている共焦点顕微鏡を使用して、水平方向の断面を活用することができます。これは、光散乱および縦置き胚の従来のZ -スタック再建で発生する蛍光染料の光退色の問題以来、定量化の目的のために大幅な改善は、現在解消されています。反対側の背腹の位置にあるセルが同時に同じ焦点Z位置で結像されているのでこのように、背腹軸に沿った遺伝子発現やタンパク質レベルの定量は、正確です。さらに、記載された方法は、私たちはDVの軸6に沿って異なる位置にあるセルを視覚化するために、複雑な計算アンロールの方法を使用せずに3 - D胚から背腹軸を介して完全な2次元画像を取得することができます。
重要なステップのいくつかは、ゼリーの2つの層の間の分裂を避けるために、胚を合わせ後に余分なグリセリンを除去含まれています。しかし、サンプルがあまりにも脱水の場合は、結果として得られる画像は不格好になると不正な形態を持つことになります。胚の周りゼリーの培地は角度ではなく、ストレートカットされている場合に加えて、、、結果として得られるイメージは、90度以外の角度で胚の不正確なポジショニングのために、形状の小さい丸とより多くの卵子の表示されることがあります。ゼリーは前方/後方端部に胚に密接に十分にカットされていない場合は最後に、、それは客観の作動距離は主にゼリーではなく胚に集中するために使用されるので、適切な画像を得ることは不可能である。
イメージング後半gastrulating胚は慎重にそれらを整列させる前に、スコープの下に関心の段階をソートするときに必要になることがありますもう一つの重要なステップ。通常、胚は縦位置で最も簡単に認識できる形態学的特性に応じてステージングされます。
この方法で作ることができる別の変更の中に蛍光染料の光退色を防ぐためにゼリーの二層にアンチフェード試薬（例えば、p -フェニレンジアミンまたはPPD）に含めることです。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
著者は、デボラハリスとダニエルマッケイには特にお世話になります。この作品のサポートは、生物学科とCWRUの芸術と科学の大学で、生物科学における学部教育の支援のためのハワードヒューズの助成金番号52005866によって提供されていました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| グリセリンゼリー封入剤 | Electron Microscopy Sciences | 17998-10 | 保存剤として低濃度のフェノールが含まれているため、フード内または換気の良い場所で使用すること。自作の封入剤のレシピはZander, 1997に記載されている。 |
| Zeiss LSM 700 共焦点顕微鏡 | Carl Zeiss, Inc. | 以下の対物レンズを使用した：Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm)、EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm)、LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm)。 | |
| 0.1% Tween 20含有リン酸緩衝生理食塩水 (PBT) | |||
| ガラス製顕微鏡スライド | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| ガラス製カバーガラス | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | サイズ 1 ½ (本研究で使用した対物レンズ専用)。 |
| ガラス製カバーガラス (支持体作成用) | Fisher Scientific | 12-544-10 | 瞬間接着剤で接着した4枚のカバーガラスを使用する。 |
| 解剖顕微鏡 | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | |
| カミソリの刃 | 鋼製バックシングルエッジ工業用ブレード | ||
| スパチュラ | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| 皮下注射針 | Fisher Scientific | 1482610 | 26 Gauge |
| ピペット | Labnet International |
参考文献
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
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