iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

サマリー

転写でRNA結合蛋白質の空間配置は、転写後調節の重要な決定要因である。したがって、我々は、RNA結合タンパク質の結合部位の正確なゲノムワイドなマッピングを可能にする個々のヌクレオチドの解像度のUV架橋及び免疫沈降（iCLIP）を開発。

要約

転写でRNA結合タンパク質（RBPs）のユニークな組成と空間配置は、転写後調節¹の多様な側面をガイド。したがって、分子レベルでの転写調節を理解することに向けた重要なステップはRBPs ²の結合部位の位置情報を得ることです。

タンパク質- RNA相互作用は、生化学的手法を用いて検討することができますが、これらのアプローチは、そのネイティブ細胞状況でのRNA結合に対処していない。ディファレンシャルディスプレイやマイクロアレイ分析（RIP -チップ^）3-5と組み合わせてアフィニティー精製や免疫沈降法を採用し、携帯環境でのタンパク質- RNA複合体を研究する初期の試み。これらのアプローチは、間接的または非生理的な相互作用^6を識別する傾向があった。特異性と位置分解能を向上させるためには、CLIP（UV架橋及び免疫沈降）と呼ばれる戦略は^7,8を導入されました。 CLIPは、UV架橋変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む厳密な精製スキームとタンパク質とRNA分子のを兼ね備えています。ハイスループットシーケンシング技術と組み合わせることで、CLIPはゲノムワイドスケールでのタンパク質- RNA相互作用（HITS - CLIPまたはCLIP - seqと呼ばれる^）9,10を研究する強力なツールとして証明されています。最近では、PAR - CLIPは^、11,12の架橋のために光反応性リボヌクレオシド類似体を使用することを導入されました。

得られたデータの高い特異性にもかかわらず、CLIPの実験は、しばしば限られたシーケンスの複雑さのcDNAライブラリーを生成します。これは部分的に共精製されたRNAの制限された量とライブラリの準備に必要な2つの非効率的なRNAのライゲーション反応によるものです。さらに、プライマー伸長アッセイは、多くのcDNAが架橋ヌクレオチド¹³で途中で切り捨てることが示された。そのような切り詰められたcDNAは、標準のクリップライブラリの準備のプロトコル中に失われます。我々は最近、より効率的な分子内cDNAを環状化（図^1）14で非効率的な分子間のRNAライゲーションのステップのいずれかに置き換えることによって切り捨てられたcDNAをキャプチャiCLIP（個々のヌクレオチドの解像度のCLIP）を、開発しました。重要なことは、切り捨てられたcDNAを配列決定する塩基の解像度でクロスリンク部位の位置への洞察を提供します。私たちは正常にゲノムワイドな規模でのhnRNP C粒子の組織を研究し、スプライシングの調節¹⁴にその役割を評価するiCLIPを適用する。

プロトコル

1。 UV架橋組織培養の細胞

1. メディアを取り出して、10cmのプレート（十分な三つの実験用）で培養した細胞を6 mlの氷冷したPBSを加える。
2. 氷の上に蓋と場所を削除します。 254nmで少なくとも150ミリジュール/ cm ²の一回照射する。
3. セルリフターでこすることにより細胞を収集する。
4. threeマイクロチューブの各々に2 mlの細胞懸濁液を移す。 4℃で10秒トップスピードでスピンは℃で、細胞をペレット化し、上清を除去します。
5. スナップインの凍結-80ドライアイスとストアの細胞ペレットを° C使用時まで。

2。ビーズの準備

1. 新鮮なマイクロチューブに実験あたり蛋白質ダイナビーズ（DYNAL、100.02）（マウスまたはヤギ抗体をプロテインGのダイナビーズを使用）100μLを加える。
2. 溶解バッファー（; 100mMのNaCl、1％NP - 40、0.1％SDS、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、100分の1プロテアーゼ阻害剤カクテルIII、Calbiochem社の50mM Tris - HCl、pH7.4）で2倍のビーズを洗浄する。
3. 20から10μgの抗体を用いた100μlの溶解バッファーでビーズを再懸濁します。
4. 30〜60分間室温でチューブを回転させる。
5. 900μlの溶解緩衝液で3倍洗浄し、4.1のステップに進むために準備されるまで最後の洗浄に残す。

3。細胞溶解および部分的なRNAの消化

1. 1mlの溶解緩衝液と1.5 mlのマイクロチューブへの転送で細胞ペレットを再懸濁します。
2. アーゼI（Ambion社、AM2295）の1 / 500希釈を準備します。 10μlのRNaseの私の希釈だけでなく、細胞溶解液に2μlのターボDNaseを追加（1 / 500アーゼIの希釈液[低アーゼ]ライブラリの準備のために使われ、50分の1希釈液[高アーゼ]抗体の特異性のために制御することが必要です） 。
3. 1100 rpmで振盪し、37℃で正確に3分間° Cのサンプルをインキュベートする。すぐに氷に転送する。
4. 4℃とライセートをクリアするには、20分間22000グラムを回転させる。慎重に（ペレットと約50μlのライセートを残す）上清を集める。

4。免疫沈降

1. ビーズ（ステップ2.5から）から、洗浄バッファーを除去し、細胞溶解液を（ステップ3.4から）を追加。
2. 4℃で2時間のサンプルを回転℃に
3. 上清を捨て、900μlの高塩緩衝液（50mMトリス- HCl、pH 7.4; 1MのNaCl、1mMのEDTA、1％NP - 40、0.1％SDS、0.5％デオキシコール酸ナトリウム）と2倍のビーズを洗浄する。
4. 900μlの洗浄バッファー（; 10mMのMgCl _{2、0.2％Tween} - 20を20mMトリス- HCl、pH7.4）で2倍洗浄する。

5。 RNA 3'末端の脱リン酸化

1. 上清を捨て、20μlのPNKミックス（15μlの水、4μlの5 × PNKのpH6.5の緩衝液[350mMTris -塩酸、pH 6.5、50mMMgCl ₂ 25mMdithiothreitol]; 0.5μlのPNKの酵素、0.5μlのRNasin [プロメガ社製]）でビーズを再懸濁します。
2. 37℃で20分間インキュベート℃に
3. 500μlの洗浄バッファーを追加し、高塩濃度緩衝液で1倍を洗う。
4. 洗浄バッファーで2倍洗浄する。

6。 3'末端をRNAにリンカーライゲーション

1. 注意深く上清を除去し、（9μlの水、20μlのライゲーションミックスでビーズを再懸濁し、4μlの4倍のライゲーションバッファー[200 mMTris -塩酸、40mのMM GCL _2、40mMのジチオスレイトール]、1μlのRNAリガーゼ[NEB];0.5μlのRNasin [プロメガ]、1.5μlのプレポリアデニル化リンカL3 [20μM];4μlのPEG400 [81170、シグマ]）。
2. 16歳で一晩インキュベート℃、
3. 500μlの洗浄バッファーを追加してから、1ミリリットル高塩濃度緩衝液で2倍の洗浄。
4. 回目の洗浄を1 mlで1 mlの洗浄バッファーで2倍とまま洗う。

7。 RNAの5'末端標識

1. 上清を除去し、ホットPNKミックス8μlでビーズを再懸濁（0.4μLPNK [NEB]; 0.8μlを³² P -γ- ATP、0.8μlの10 × PNKバッファ[NEB]、6μlの水）。
2. 37℃で5分間インキュベート℃を
3. ホットPNKミックスを削除し、20μlの1 × Nupageのローディングバッファー（Invitrogen）中でビーズを再懸濁します。
4. ℃で10分間、70℃サーモミキサーでインキュベートする。
5. すぐに沈殿するために磁石の上に空のビーズを配置し（ステップ8を参照）ゲル上清をロードする。

8。 SDS - PAGEおよび膜の転送

1. 4-12％NuPAGE製造業者の指示に従ってビス - トリスゲル（Invitrogen社）にサンプルをロードする。緩衝液（Invitrogen）を実行して1 × MOPS 0.5リットルを使用してください。また、事前に染色されたタンパク質サイズマーカー（たとえば、このページの定規に加え、Fermentas、SM1811）の5μlをロードする。
2. 180℃で50分間ゲルを実行V.
3. ゲルの前面を削除し、固形廃棄物（遊離放射性ATPを含む）として廃棄する。
4. ゲルからメーカーの指示（Invitrogen社、30 Vで転送1時間）に応じてNOVEXウェット転写装置を用いてニトロセルロース膜にタンパク質- RNA複合体を転送する。
5. 転送後、PBSバッファーでメンブレンを洗い流した後、サランラップに包んで、-80 ° C（場所後のtを揃えるために膜の横の蛍光ステッカーをで富士フィルムに公開彼フィルムとメンブレン、30分、1時間と一晩のためのエクスポージャーを実行）。

9。 RNA分離

1. マスクとして、ステップ8.5からオートラジオグラフを用いて、低RNaseの実験から、タンパク質- RNA複合体を分離する。いくつかの小さなスライスに膜のこの部分を切り取り、1.5 mlマイクロチューブに入れます。
2. 膜片にし、10μlのプロテ​​イナーゼK（ロシュ、03115828001）200μlのPKバッファー（10mMのEDTA; 50mMのNaCl 100mMのトリス- HCl pH7.4）を追加します。 37℃で20分間1100 rpmで振盪しながらインキュベート℃を
3. PKureaバッファ（; 50mMのNaCl、10mMのEDTA、100mMトリス- HCl pH7.4の7 M尿素）200μlを加え、37℃で20分間インキュベート℃を
4. 解決策を収集し、RNAをフェノール/クロロホルム400μlの（Ambion社、9722）2 mlの位相ロックジェルヘビーチューブ（713〜2536、VWR）にそれを一緒に加える。
5. 1100 rpmで振盪し、30℃で5分間℃でインキュベートする。室温で13,000 rpmで5分間回転させて位相を区切ります。
6. （ピペットでゲルに触れないよう注意してください）​​を新しいチューブに水層を移す。 0.5μlのglycoblue（Ambion社、9510）と40μlの3 M酢酸ナトリウム液（pH5.5）と混合する。その後、1ミリリットルの100％エタノールを加える、-20℃で一晩再び混合し、沈殿

10。逆転写

1. 15000回転、4で20分間スピン℃に上清を除去し、0.5ml 80％エタノールでペレットを洗浄。
2. 7.25μlのRNA /プライマーミックスでペレットを再懸濁し（6.25μlの水、0.5μlのRCLIPのプライマー[0.5pmol/μl];0.5μlのdNTPミックス[10mMの]）。各実験や複製については、個々のバーコードのシーケンスを（14を参照）を含む異なるRCLIPのプライマーを使用してください。
3. 70℃で5分間インキュベート° C 25℃に冷却する前に
4. 2.75μlのRTミックス（;0.5μlの0.1M DTT、0.25μlを上付きIII逆転写酵素[インビトロジェン] 2μlの5 × RTバッファー）を追加します。
5. ° C、42℃で20分° C、50℃40分80℃、5分間4℃℃に冷却する前に、Cは25で5分間インキュベート
6. 90μlのTEバッファー、0.5μlのglycoblueと10μlの酢酸ナトリウムのpHは5.5とミックスを追加。その後、250μlの100％エタノールを追加し、-20℃で一晩再び混合し、沈殿

11。 cDNAのゲルの浄化

1. スピンダウンすると（10.1を参照）のサンプルを洗い、その後水6μlにペレットを懸濁します。
2. 6μlの2 × TBE -尿素のローディングバッファー（Invitrogen社）を追加します。熱サンプルを80℃に直接ロードする前に、3分間。
3. プレキャスト6パーセントTBE -尿素ゲル（Invitrogen社）にサンプルをロードし、製造業者によって説明されているように180 Vで40分間実行する。また、その後のカット​​（下記参照）のための低分子量マーカーをロードする。
4. 120から200 NT（高）、85から120ヌクレオチド（培地）と70〜85ヌクレオチド（低）で3つのバンドをカット。 theupperの染料と（図3を参照）切除を導くためにプラスチック製のゲルのサポート上のマークを使用してください。そのRCLIPのプライマーおよびL3のシーケンスが一緒にCLIPのシーケンスの52 NTのアカウントを注意してください。
5. 400μlのTEを追加し、1 mlのシリンジのプランジャーを使用して小片にゲルスライスを押しつぶす。 37℃2時間1,100 rpmで振盪しながらインキュベート℃に
6. 場所コスターSpinXの列（コーニング社、8161）に2つの1 cmのガラスプレフィルター（ワットマン、1823010）。カラムにサンプルの液体部分を転送します。 1.5 mlチューブに13,000 rpmで1分間スピン。
7. 0.5μlのglycoblueと40μlの酢酸ナトリウムのpHは5.5を追加してから、サンプルを混ぜる。 1ミリリットルの100％エタノールを追加し、-20℃で一晩再び混合し、沈殿

12。 cDNAの5'末端にプライマーのライゲーション

1. スピンダウンとサンプルを洗う（10.1参照）、その後、8μlのライゲーションミックスでペレットを再懸濁（6.5μlの水、0.8μlの10xのCircLigaseバッファーII、0.4μLの50mMのMnCl _2を 、0.3μL、Circligase II [EPICENTRE]）とインキュベート60℃で1時間
2. 30μlのオリゴアニーリング混合追加（26μlの水を、3μlのFastDigestバッファ[Fermentas];1μlのcut_oligo [10μM]）。 95℃で1分間インキュベート℃にその後、毎20秒に1ずつ温度を下げる° Cを25日まで℃に達しています。
3. 2μlのBamHI部位（高速Fermentas）と37℃で30分間インキュベート℃を追加
4. 50μlのTEおよび0.5μlのglycoblueとミックスを追加。 10μlの酢酸ナトリウムのpHは5.5とミックスを追加してから、250μlの100％エタノールを加える。 -20℃で再び混ぜ合わせ、一晩沈殿

13。 PCRの増幅

1. スピンダウンすると（10.1を参照）のサンプルを洗浄し、19μlの水でペレットを再懸濁します。
2. （;1μlのプライマー混合P5/P3 solexa、10μMの各、20μlのAccuprimeスーパーミックス1酵素[インビトロジェン] 19μlのcDNA）をPCRミックスを調製する。
3. 以下のPCRのプログラム実行_{：25-35サイクル} 、68℃で3分間、4 [30秒、94℃で15秒、65℃で30秒→68℃] 94℃2分間を、° C永遠に。
4. プレキャスト6パーセントTBEゲル（Invitの2 5倍TBEローディング緩衝液の液と負荷で8μlのPCR産物を混ぜてロゲン）。 Sybrgreen I（Invitrogen社）でゲルを染色し、ゲルイメージャーで分析する。
5. RCLIPのプライマーのバーコードは、ハイスループットシーケンシングのために提出する前に、多重異なるサンプルすることができます。シークエンシングのためのライブラリの15μLを提出し、残りを保存する。

14。リンカーとプライマー配列

プレポリアデニル3'リンカーDNA：

[我々は、20μMのアリコートを作成してIDTからDNAアダプターを注文して。]

15。代表的な結果：

膜の転送（ステップ8.5）およびPCR産物（ステップ13.4）のゲルイメージの後にタンパク質- RNA複合体のオートラジオグラフ：iCLIPライブラリの塩基配列決定に先立って、実験の成功は、2つの手順でモニターできます。低RNaseの試料のオートラジオグラフでは、びまん性放射能はタンパク質の分子量（図2、サンプル4）の上に見られるべきである。高のRNaseのサンプルの場合は、この放射能が近いタンパク質の分子量（図2、サンプル3）に焦点を当てています。は抗体が免疫沈降で使用されていない場合、シグナルは（図2、サンプル1及び2）検出されるべきである。免疫沈降の特異性のためのさらなる重要な制御には、関心¹⁴のタンパク質を発現していないUV照射または使用セルを省略する。

PCR産物（ステップ13.4）のゲルイメージは、ステップ11.4（図4、レーン4-6）で精製したcDNAの割合（高、中、低）に対応するサイズの範囲を示す必要があります。 PCRプライマーP3SolexaとP5SolexaはcDNAのサイズに追加の76 NTを導入することに注意してください。は抗体が免疫沈降中に使用されていない場合は、対応するPCR産物が（図4、レーン1-3）を検出するべきではありません。プライマーダイマーの製品は、約140 NTで表示できます。

ハイスループットシーケンシングおよびその後のバイオインフォマティクス解析の代表的な結果を得るために^14を参照してください。

図1。iCLIPプロトコルの模式図。タンパク質- RNA複合体は、UV照射（ステップ1）を用いてin vivoで共有結合をクロスリンクされています。目的のタンパク質が結合したRNA（ステップ2-5）と一緒に精製される。最後放射能（ステップ6および7）ラベル付けされている逆転写の配列特異的なプライミングを可能にするため、RNAのアダプタは、5'のに対し、RNAの末尾"を3に連結される。架橋タンパク質- RNA複合体はSDS - PAGEおよび膜の転送（ステップ8）を使って無料のRNAから精製されています。 RNAは、プロテイナーゼKは、ヌクレオチドのクロスリンク（手順9）で、残りのポリペプチドを残してタンパク質を消化することにより膜から回収される。逆転写（RT）は、残りのポリペプチドで切り捨て二開裂可能なアダプタ領域とバーコードシーケンス（ステップ10）を紹介します。サイズの選択は、環状化する前に無料のRTプライマーを削除します。以下の線形化は、PCR増幅（ステップ11-15）に適したテンプレートを生成します。最後に、ハイスループットシーケンシングは、バーコードシーケンスがすぐに（ステップ16）cDNAの最後のヌクレオチドが続いているの読み取りを生成します。このヌクレオチド位置するので上流に架橋された塩基、結合部位の一つ上の位置は、高分解能で推定することができます。

図2架橋hnRNP C - RNA複合体のオートラジオグラフは、変性ゲル電気泳動およびメンブレンの転送を使用して。 hnRNP C - RNA複合体は、hnRNP C（αhnRNP C、試料3および4）に対する抗体を用いた細胞抽出物から免疫精製した。 RNAが部分的に低い（+）または高を用いて消化した（+ +）に含まれるRNaseの濃度。タンパク質のサイズ（40 kDa）をから上方にシフトする複合体は、（サンプル4）観察することができます。 RNaseの高濃度（試料3）を使用したときのシフトはあまり顕著です。は抗体が免疫沈降（サンプル1及び2）で使用されなかったときに放射性シグナルが消えます。

iCLIP cDNA産物の切除を導くために図3。回路図を6％TBE -尿素ゲル（Invitrogen社）。ゲルは、ゲル中のcDNAおよび色素（青色光と闇）の再現可能な移行パターンにつながる180 Vで40分間実行されます。 （赤線）、高（H）、ミディアム（M）、および低（L）cDNAの分画をカットするためにカミソリの刃を使用してください。ライトブルーの染料の途中で、すぐにプラスチック製のゲルカセット上にマークが上記切断することから始めます。培地と低い分画を分割し、水色色素上記の約1cmの高い割合をトリミング。ポケットと別の車線を（この例1-4）を分離する色素によって導か垂直カットを使用してください。マーカーレーン（m）を制御するために染色し、画像化することができます切断後のサイズ。フラグメントサイズは​​、右上に表示されます。

図4。ゲル電気泳動を用いてPCR増幅iCLIP cDNAライブラリーの解析。膜（図1）から回収したRNAは逆転写であり、変性ゲル電気泳動（図2）を使用してサイズを精製。 cDNAの3つのサイズ分画（高[H]：120〜200 NT、培地[M]：85から120 NTおよび低[L]：70から85ヌクレオチド）は環状、再線形化、回収してPCR -増幅した。異なるサイズ分布のPCR産物は、入力画分の異なるサイズの結果として観察することができます。 PCRのプライマーは、cDNAを、76 NTを導入しているので、大きさは中、低のサイズ分画のための146から161 NTのために高い、161〜196 ntのために196から276 NT間の範囲にしてください。は抗体が免疫沈降（レーン1-3）のために使用されていないときにPCR産物は存在しない。

ディスカッション

iCLIPプロトコルは、酵素反応と精製段階の多様な範囲を含んでいるので、それは実験が失敗する問題を識別するために、必ずしも容易ではない。同定されたRNAの相互リンクサイトの特異性をコントロールするために、一つ以上のネガティブコントロールは、完全な実験とその後の計算論throughout維持されるべきである。これらのコントロールは、非抗体サンプル、非架橋の細胞、またはノックアウト細胞や組織から免疫沈降することができます。理想的には、これらの対照実験では、任意のタンパク質- RNA複合体を浄化してはならないため、SDS - PAGEゲル上に信号を与えないこと、およびPCR増幅後には検出可能な製品があります。これらの制御ライブラリのハイスループットシーケンシングは非常にいくつかのユニークな配列を返す必要があります。結果のシーケンスはまだ少量でノックダウン細胞から精製されているのと同じタンパク質の架橋部位に対応するので、ノックダウン細胞は、シーケンシング制御としては推奨されません。

注意事項は、以前の実験からのPCR産物の混入を避けるために注意する必要があります。この問題を最小限にする最良の方法は、事前事後のPCRステップを空間的に分離することです。理想的には、PCR産物とすべての後続のステップの分析は別の部屋で実行する必要があります。また、研究室の各メンバーは、バッファや他の試薬の独自のセットを使用する必要があります。この方法では、汚染の源は簡単に識別することができます。

材料

試薬の名前	会社	カタログ＃	コメント
タンパク質のDynabeadsを	インビトロジェン	10001D	マウスまたはヤギ抗体のプロテインGを使って
リボヌクレアーゼI	アンビオン	AM2295	活動は、バッチ毎に変更することができます。
T4 RNAリガーゼI	NEB	M0204S
PNK	NEB	M0201S
プロテイナーゼK	ロッシュ	03115828001
上付き文字III逆転写酵素	インビトロジェン	18080044
Circligase II	EPICENTRE	CL9021K
FastDigest ®をBamHI	Fermentas	FD0054
AccuPrime™スーパーミックスI	インビトロジェン	12342010	このPCRミックスは、私たちの手で最高の結果が得られます