方法論記事

細胞星状に7つのステップ

DOI：

10.3791/2710

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2011年5月10日

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1Immune Disease Institute, Program in Cellular and Molecular Medicine at Children's Hospital, Department of Pathology, Harvard Medical School

この記事について

サマリー

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ここでは、マウスの肝臓から肝星細胞の単離のための方法を説明します。星状細胞の精製のために、マウスの肝臓は、消化されていますその場でと in vitroで密度勾配遠心分離の前にプロナーゼ、コラゲナーゼ処理による。この手法は、高純度の肝星細胞が得られます。

要約

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肝星細胞は星状形態の肝臓常駐細胞であり、肝類洞内皮細胞と肝細胞の1,2の間にDisseの空間に配置されています。星状細胞は、骨髄の前駆体に由来し、全身のビタミン1、2の80％にまで保存されています。活性化されると、星状細胞は、このように肝線維症3に貢献し、細胞外マトリックスを生成するために筋線維芽細胞に分化する。契約する能力に基づいて、筋線維芽細胞星状細胞は、門脈圧亢進症4に関連血管緊張を調節することができる。最近、我々は、肝星細胞は、強力な抗原提示細胞であり、NKT細胞だけでなく、従来のTリンパ球5をアクティブにすることができます示した。

ここでは、マウスの肝臓から肝星細胞の効率的な製造方法を示す。そのperisinusoidalローカライズのために、肝星細胞の分離は、マルチステップのプロセスです。 Disseのスペースから分離へのアクセス星状細胞をレンダリングするためには、マウスの肝臓は、消化酵素のプロナーゼEとコラゲナーゼP.以下の血流とその場で灌流され、肝臓の組織は、プロナーゼEとコラゲナーゼP の持つ追加の酵素処理に供される試験管 。その後、このメソッドは、肝星細胞のビタミンA -を格納する脂肪滴の膨大な量を利用しています。この機能は8％ナイコデンツの勾配で遠心分離によって、他の肝細胞型から星状細胞を分離することができます。ここで説明するプロトコルは、星状細胞の非常に純粋で均一な人口をもたらします。調剤の純度は、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによる分析の前にマーカー分子グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、のために染色によって評価することができる。さらに、光学顕微鏡では脂肪滴を大量に抱いて星型肝星細胞のユニークな外観を明らかにする。

一緒になって、我々は、その形態学的外観および星状細胞の実体を定義するために役立つGFAPの発現の代表画像を含む肝星細胞の効率的な分離のための詳細なプロトコールを提示する。

プロトコル

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C57BL / 6マウスは〜20週齢以上で使用してください。 25〜30グラムの重さ、雄マウスの使用が推奨されています。星状細胞の収量は、細胞の分離を星状に先立って2ヶ月のためにマウスにビタミンAに富む食事を供給することにより増加することができます。 Balb / cマウスからの肝星細胞の収率がかなり高いのに対し、約2 × 10 5肝星細胞は、一つC57BL / 6マウスの肝臓から精製することができる。以下のプロトコルは、5匹のマウスに調整されます。動物のケアと実験が承認された動物実験に基づき行われ、委員会のプロトコルを使用していた。

（1）マウスの肝臓の in situ灌流の消化酵素で

  1. 37℃の水浴中でSC1バッファーと酵素の灌流液を温める。
  2. 蠕動ポンプのシリコンチューブにセット翼の注入をマウントします。
  3. 肝臓の現場灌流のために使用される流量である6.5ml/min、の層流を得るためにPBSでポンプのキャリブレーション。 SC1溶液をシリコンチューブを平衡化する。
  4. ケタミン（90 mg / kg体重）及びキシラジン（10 mg / kg）のソリューションと深いnarcotizationを確保するために反射の消失のためのテストの腹腔内注射によってマウスを麻酔。
  5. 適当な塩基での仰臥位でマウス....

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ディスカッション

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肝星細胞は肝臓に不可欠な生理学的および病態生理学的プロセスを調節する。また、星状細胞は、それらを肝免疫応答の重要な構成要素をレンダリングする、抗原提示特性を有する。肝星細胞が肝臓の総細胞数の10〜15％を占めるが、これらの細胞の分離は、Disseの類洞周囲腔に局在のために挑戦している。

ここでは、 現場消化およびその後の勾配遠心分離のことで、マウスの肝臓から肝星細胞を分離する簡単な方法を提示する。このプロトコルは、免疫学的アッセイに適した高純度の星状細胞の単離を可能にします。

単離された細胞の実体は、星状、核周囲のビタミンを格納する脂質小胞、およびGFAPの発現を含む、肝星細胞の三大特徴を、考慮して制御することができます。免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーによって評価されるようにこれらの基準によると、記述されたプロトコルを使用して得られる星状細胞は、日常的に〜99％純粋です。星状細胞のアイソレーションの潜在的な汚染物質は、クッパー細胞と肝臓の樹状細胞（DC）です。したがって、我々は、表面.......

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開示事項

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利害の衝突は宣言されません。

謝辞

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この作品は、生物医学研究とNIH RO1 AI083426 - 01（FW）の卓越性のためのスミスファミリー賞によって資金を供給された。パトリックMaschmeyerとメラニーフラックは、ベーリンガーインゲルハイム財団からの博士課程の奨学金によってサポートされています。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前会社商品番号
70μmセルストレーナー BD 352350
塩化カルシウム2 × 2H 2 O シグマアルドリッチ C3306
コラゲナーゼP ロッシュ 11249002001
DMEM ギブコ 11960
DNase Iをロッシュ 10104159001
DPBS Cellgro 21から031 - CV
EGTA フルカ 3777
ウシ胎仔血清ギブコ 16000
グルコースシグマアルドリッチ G7528
勾配遠心チューブグライナーバイオワン 163160
HEPES ギブコ 15630
KCL シグマアルドリッチ P9541
KH 2 PO 4 シグマアルドリッチ P9791
L -グルタミンギブコ 25030
のMgCl 2 × 6H 2 O フルカ 63068
し、MgSO 4 × 7H 2 O シグマアルドリッチ M2773
のNa 2 HPO 4 × 2H 2 O フルカ 71643
NaClのシグマアルドリッチ S3014
のNaH 2 PO 4 × H 2 O フルカ 71507
NaHCO 3の フルカ 71628
ナイコデンツ Accudenz AG AN7050/BLK
ペニシリン/ストレプトマイシンギブコ 15140
蠕動ポンプコー​​ルパーマー HV - 7523〜70
フェノールレッドシグマアルドリッチ P4633
プロナーゼE カルビオケム 7433から2
シリコンチューブ Masterflex HV - 96440〜14
ピルビン酸ナトリウムギブコ 11360
組織培養フラスコ（25センチメートル2） BD 353108
翼の輸液セットテルモ 1SV27EL

参考文献

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  1. Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
  2. Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate ....

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タグ

Nycodenz Pronase E P GFAP

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