方法論記事

ToxRアッセイによって決定される膜貫通ドメインのオリゴマー化の傾向

DOI：

10.3791/2721

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2011年5月26日

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Colorado at Boulder

この記事について

サマリー

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一回膜貫通ドメイン（TMDS）のオリゴマー化の傾向を評価するための効率的な手順が説明されています。 ToxRに融合されたTMDからなるキメラタンパク質は、大腸菌のレポーター株に発現されています。 TMD誘発性オリゴマーはToxR、転写およびレポータータンパク質の生産、-ガラクトシダーゼの活性化の二量体化を引き起こす。

要約

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リン脂質二重層で単にアンカーとしてのタンパク質の膜貫通ドメインの極端に簡略化ビューには、誤りであるので、長く持っています。多くの場合、膜貫通タンパク質は、アクションの非常に高度なメカニズムを進化させてきた。膜タンパク質はその構造と機能を調節することができる1〜3つの方法は、構造化された膜貫通のオリゴマーを形成する、疎水性ヘリックスの直接および特定の連絡先があります。4,5多くの最近の作業は6,7は 、それにもかかわらず。優先的に水溶液とドライブの蛋白質の関連付け、異なる分子間力と比較して膜の環境で見つかったアミノ酸の分布に焦点を当てているタンパク質の膜貫通ドメインにおける分子認識の研 ​​究は、まだのものに遅れている水溶性の領域。主要なハードルが残っている：貫通オリゴマー化が達成できる驚くべき特異性と親和性にもかかわらず、それらの関連の8の直接測定が困難です。内在性膜蛋白質機能の研究に適用される伝統的な方法論が検討中のシーケンスの固有の不溶性によって妨げられることができる。膜貫通ドメインを表す合成ペプチドを研究から得られた生物物理学的な洞察は、有用な構造的洞察を提供することができます。しかし、細胞膜を模倣するためにこれらの研究で使用される洗剤ミセルまたはリポソーム系の生物学的関連性はしばしば疑問視され、ペプチドは、これらの条件の下で天然様の構造を採用していないと各機能の動作は、真のネイティブ膜内で作用機序を反映していない？天然のリン脂質二重層の膜貫通配列の相互作用を研究するためには、LangoschラボはToxR転写レポーターアッセイを開発した。関心の9膜貫通ドメインがペリプラズムとToxRの位置については、マルトース結合タンパク質とのキメラタンパク質として発現されるレポートを提供するオリゴマー化のレベル（図1）の。

過去10年間で、いくつかの他のグループ（例：エンゲルマン、DeGrado、シャイ）さらにこのToxRのレポーターアッセイを最適化し適用した。10-13、様々なToxRアッセイは、細胞膜のタンパク質間相互作用をテストするためのゴールドスタンダードとなっています。我々はここに主にLangoschによって開発されたプロトコルを、次の我々の研究室で行われた代表的な実験操作を示す。この一般的に適用できる方法では、E.の膜貫通ドメインの自己会合の解析に有用です。 β-ガラクトシダーゼの生産はTMDオリゴマー化の傾向を評価するために使用される大腸菌 、。 TMD誘発性二量体化すると、ToxRはβ-ガラクトシダーゼのLacZ遺伝子のアップレギュレーションを引き起こすCTXのプロモーターに結合する。比色読み出しはlyzed細胞へのONPGを添加することによって得られる。光吸収の種O - nitrophenolate（ONP）（図2）の産生におけるβ-ガラクトシダーゼの結果によるONPGの加水分解。

プロトコル

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1。クローニングの考慮事項

  1. NheIとBamHIの制限部位と5' -リン酸化によって挟ま関心のTMDを表す商業的に作製したオリゴヌクレオチドを順次消化pTox7（直接BamHI制限部位14日以降1塩基対の挿入によって私たちの研究室で修正された）（図3）に連結することができるBamHIおよびNheIで。例のオリゴヌクレオチドを​​以下に示します。
    5'ctagcTMDSEQUENCEg3"
    3'gTMDSEQUENCEcctag5"

TMDシーケンスは、12から24残基（より短い配列はおそらくベクトル符号化された疎水性残基により伸長される）でなければなりません。ここで、逐次残渣の挿入とToxRに対するTMDの相対的な回転に付随する残基の欠失の結果TMD設計4つのバリエーションを作成する必要がある、インタフェースを調査するために。最後に15,16は 、アラビノース濃度は0.001と0.01％の間で変化させてください（w / v）の異なるTMD配列の間のβ-ガラクトシダーゼの信号の最大の違いが観察される濃度を識別するために、異なる発現レベルをテストすること、異なる親和性が最高の区別することができる条件を特定することをお勧めします。アラビノースと抗生物質、0.4mMのIPTGに加えて別のTMDSとの間の親和性の違いを高めるために使用することができます。 ToxRの測定は、少なくとも4連....

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ディスカッション

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ToxR転写レポーターアッセイでは、オリゴマー化する可能性と膜貫通配列を同定するために手軽な方法です。相互作用が細菌の内膜内に発生しているので、このアッセイは、細胞膜模倣環境でシステムを研究の妥当性に関連する問題を回避することができます。単一のプラスミドに複数のTMDSのクローニングを容易に並列に行うことができ、全体のアッセイは96ウェルプレートフォーマットで行うことができることを考えると、このアッセイは、タンパク質配列の多数のハイスループット解析に使用することができます。17いったん相互作用が検出された、キーの機能残基が関与する構造的特徴のマッピングを可能にする、変異解析によって調べることができます。多くの場合、膜貫通型タンパク質の結晶構造解析は、機能の分子基盤を確立するためにそのようなToxRアッセイなどの代替ツールを必要とする、問題があります。

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開示事項

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利害の衝突は宣言されません。

謝辞

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我々は、国立衛生研究所を（1R21CA138373感謝し、この作品の金融支援のためのがん（SU2C）にスタンドアップ。HYのためのシドニーキンメル財団からのがん研究、キンメルScholarの賞の協会から2009年エリオン賞に感謝です。がん研究（SKF - 08 - 101）、および国立科学財団の学部初期のキャリア賞（NSF0954819）。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前会社カタログ番号コメント（省略可能）
BamHI制限酵素インビトロジェン 15201023 インビトロジェンの酵素は、代替のサプライヤーよりも効率的であることがわかった
NheI制限酵素インビトロジェン 15444011 インビトロジェンの酵素は、代替のサプライヤーよりも効率的であることがわかった
15 mLの培養管フィッシャーサイエンティフィック 14から956 - 1J
SOCメディア Teknova S0225 適切なボリュームに構成し、オートクレーブにより滅菌。
LB培地シグマアルドリッチ L7275 適切なボリュームに構成し、オートクレーブにより滅菌。
クロラムフェニコールシグマアルドリッチ CO 3位 78 冷凍庫に保存されているエタノール30 mg / mLの原液
アラビノースフルカ 10839 水中の2.5％ストック溶液（w / v）を冷凍庫に保存され
のNa 2 HPO 4 シグマアルドリッチ S9390
のNaH 2 PO 4 シグマアルドリッチ S9638
塩化カリウム Mallinckrodtケミカルズ 6858〜06
のMgSO 4 · 7H 2 O シグマアルドリッチ 63138
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） シグマアルドリッチ L6026
2 - ニトロフェニルβ- D -ガラクトピラノシド（ONPG） シグマアルドリッチ 73660
Z -バッファ 16.1グラムのNa 2 HPO 4
5.5グラムのNaH 2 PO 4
0.75グラムのKCl
0.246グラムのMgSO 4
1リットル、pH7.0にメイクアップ
Z-buffer/chloroform 200mLのβ-メルカプトエタノール、2 mLのクロロホルム、Z -バッファ、20 mLに構成しています。 1分間、800 rpmで1分間遠心するための渦。各プレートのための新鮮ください。
Z-buffer/SDS 10mLのZ -バッファに溶解した160 mgのSDS
Z-buffer/ONPG 10mLのZ -バッファの40 mgをONPG。各プレートのための新鮮な確認
β-メルカプトエタノールカルビオケム 444203
抗MBP抗体（HRP標識） NEB E8038S
マルトースと最少培地 1 × M9塩、0.4％マルトース、1 mg / mLのチアミン、2mMのMgSO 4を
96ウェル平底プレートザルスタット 83.1835.300
プレートリーダーベックマンコールター DTX880マルチモード検出器
ウォーターバス VWRI 89032-204
振とう培養器 FormaScientific

参考文献

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  1. Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
  2. Mo, W., Zhang, J. T.

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ToxR ONPG

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