酸化的細胞の環境を検出するスクリーニング法は、CM - H2DCFDAの酸化を測定することです。かつて非蛍光からの蛍光化合物に細胞、CM - H2DCFDA変化の中で酸化する。蛍光の変化はフローサイトメトリーで測定し、酸化的環境における細胞の数を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
神経損傷を誘発したウイルスの多くの場合、提案されたメカニズムは、酸化ストレスです。星状膠細胞は、中枢神経系（CNS）の酸化ストレスの制御に重要な役割を担っている。星状膠細胞は、活性酸素種（ROS）から神経細胞を保護するだけでなく、神経細胞のための恒常的な環境を維持するのに役立ちます。 CM - H2DCFDAは、ROSの存在のための細胞透過性の指標です。 CM - H 2 DCFDAは非蛍光化合物として細胞に入り、そして細胞のエステラーゼが酢酸基を除去した後、蛍光灯になり、そして化合物が酸化される。緑色の蛍光であることが判明しているフローサイトメトリーによって測定された細胞の数は、、酸化状態にある細胞の数を示しています。 CM - H 2 DCFDAは異なるROSの多数による酸化を受けやすくなります。このアッセイは関係なく、酸素の酸化的細胞環境のために画面に使用できるようにROSがCM - H 2 DCFDAを酸化させることができるかに関する特異性の欠如は、、、この化合物病因調査の初期段階で使用するための貴重な摂政ですラジカルやROSの組み合わせは、細胞の条件のための責任があります。それは、ROSがCM - H 2 DCFDAの酸化によって存在することが確立されると、その後の追加実験がROSやロスの組み合わせが特定の病因のプロセスに関係しているかを判定するために実施することができます。この研究の結果は、過酸化水素の添加によりCM - H 2 DCFDAの増加はこのアッセイは、G355 - 5細胞内酸化的環境を検出するための貴重なテストであることを示す、生理食塩水対照と比較して検出された蛍光を発することを示しているネコのアストロサイト細胞株。
プロトコル
1。セルの猫アストロサイトの培養およびH 2 O 2による治療
- 37 DMEMのメディアに加え、栄養素が75 cm 2のフラスコでの培養細胞株G355 - 5℃、5％CO 2 60％コンフルエント（〜5日）まで。すべての1〜2日メディアを交換するかなど、健全な文化を維持するために必要。
- メディアを取り出して、0.25％トリプシン液2 mlを加える。 45秒のためにピペッティングして細胞を持ち上げ - 室温で1分（RT）。
- すぐにメディアの10mlを含む15mlコニカルチューブに懸濁液を移す。穏やかに混合する。
- ペレットを得るために3分間採り、300 xg、23℃で遠心する。ペレットが剥がれないように上清を捨てる。
- 新鮮な培地6〜7 mlを加え、細胞を懸濁します。
- 6ウェルプレートの各ウェルに細胞を約1 mlを加え。各ウェルにメディア2〜3 mlを加え80〜90％コンフルエントになるまでインキュベートする。
- メディアの過酸化物の100μM溶液（H 2 O 2）を準備する。
- 各ウェルから培地を取り除き、どちらかの2ミリリットル新鮮な培地（コントロール）、H 2 O 2（治療）またはDPBSの2ミリリットルの2mlで....
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ディスカッション
神経損傷を誘発したウイルスの多くの場合、提案されたメカニズムは、酸化ストレス1、4、7、9、13、15、16、18-22、27、31です。基本的に、それが神経細胞に有毒であるなどの水酸化物、スーパーオキシドアニオン、一酸化窒素、および/または過酸化水素、などのウイルス暴露によるグリア細胞（アストロサイトとミクログリア）放出、活性酸素ラジカル、ことが提案されている。同様に、酸化ストレスはまた、メタンフェタミン誘発性神経毒性2、6、17の主要な病理学的メカニズムとして提案されている。私たちのグループはCNSの悪用のウイルスと薬の両方の効果に興味を持っているので、我々は、星状膠細胞の過剰活性酸素の存在を決定するために迅速なスクリーニングテストを使用することを選択。神経グルタチオンの大部分はアストロサイトで産生され、その後ニューロン5、8、10-12、24、26、29、30に配信されます。従って、酸化ストレスのアストロサイトの役割は、ニューロンのための恒常的な環境を維持するだけでなく、ROSからニューロンを保護する上で重要であり、アストロサイト細胞培養がこの研究のために選ばれたこ.......
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開示事項
我々はこれらの研究への惜しみない支援のためのReadiSorb製品に感謝。
謝辞
我々はこれらの研究への惜しみない支援のためのReadiSorb製品に感謝。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント（省略可能） |
| DMEM | Cellgro | 15から013 - CV | |
| MEMビタミン | Cellgro | 25から020 - CL | 1％（v / v）の |
| L -グルタミン | Hyclone | 17 - 605E | 1％（v / v）の |
| 非必須アミノ酸 | Hyclone | 25から025 - CL | 1％（v / v）の |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20％（v / v）の |
| 必須アミノ酸 | Cellgro | 25から030 - CL | 0.2％（v / v）の |
| 500ミリリットル真空ろ過システム | VWR | 87006-076 | |
| 15 mlコニカルチューブ | ファルコン | 352097 | |
| 75センチメートル2組織培養フラスコ | ファルコン | 353136 | |
| 6ウェル組織培養プレート | ファルコン | 353224 | |
| CM - H 2 DCFDA | インビトロジェン | C6827 | |
| ヨウ化プロピジウム（PI） | シグマ | P4170 - 10mgの | |
| トリプシン | ロンザ | 17 - 160F | |
| H 2 O 2 | シグマ | H6520 | |
| 抗生物質HYQ | Hyclone | SV30079.01 | 0.1％（v / v）の |
| G355 - 5細胞 | ATCC | CRL - 2033 | 通常の猫の脳 |
参考文献
- Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease. J Exp Med. 181, 735-745 (1995).
- Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C....
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再版と許可
