機能心臓の免疫細胞の単離

サマリー

心臓から機能的な免疫細胞を単離するためのこの方法では、これらの細胞の反応性の低下、その結果、不要な免疫細胞の活性化を引き起こすコラゲナーゼ消化、の従来の方法に代わる方法が用意されています。分離の手法は、酵素消化に関連する問題を回避することによって機能的な心臓の免疫細胞が得られます。

要約

。心臓の免疫細胞は肥満細胞、T細胞およびマクロファージを含む^1月5日 、これらの免疫細胞は、彼らは多くの心臓疾患の病理学的リモデリングにおいて果たす役割に関心を集めている、店舗やサイトカインを含む生物学的活性のメディエーターの様々を解放し、このようなトリプターゼとしてプロテアーゼ^。6-8これらのメディエーターは、マトリックスメタロプロテアーゼの活性化や変調心臓線維芽細胞"機能により、コラーゲンの蓄積を引き起こすことにより細胞外マトリックスの代謝に重要なプレーヤーであることが示されている^。9-11しかし、心臓の免疫細胞を単離するために利用できる技術は持っている彼らは心筋組織を消化する細菌性コラゲナーゼを使用するため、問題となって。この手法は、免疫細胞の活性化とそのための機能が失われます。例えば、心臓の肥満細胞が脱顆粒を引き起こす化合物を大幅に軽減応答になる^。12だから、我々はtを可能にする技術を開発彼の心疾患におけるこれらの細胞の役割の理解につながる機能性心臓免疫細胞の分離^。13、14

このメソッドは、解剖学的なラットの剣状突起、腋窩および鎌状靱帯の位置、および心臓の心膜に精通している必要があります。これらのランドマークは、プロシージャの成功を増加させると心臓の免疫細胞のより高い利回りを確保することが重要です。これらの孤立した心臓の免疫細胞は、機能性、表現型、成熟度、および他の心臓の細胞との共培養実験その相互作用の理解を得るための特性評価に使用することができます。

プロトコル

1。ハンクスバランス塩溶液の調製（HBSS）

1. オートクレーブ1Lのガラスビーカー、1000mLのはメスシリンダー、そしてバーをかき混ぜる。
2. 再蒸留水で900mLのマークにオートクレーブ1リットルのガラス製ビーカーにHBSS粉のソリューションを再構築。
3. ヘペスのNa +塩3.4 gをとりHBSS溶液を混和し、濃塩酸や水酸化ナトリウムのいずれかを使用して7.35から7.41の間の値にpHを調整する。
4. 所望のpHが達成し、安定した状態でされると、アルブミンが完全に溶解するまで室温で溶液にウシ血清アルブミン5gを加える。
5. 総量1000 mlのマークになるまでのソリューションに、antimyotic、抗生物質と蒸留水10 mLを加え。
6. 徹底的に解決策をかき混ぜる。
7. HBSS溶液をフィルタリングし、後で使用するために50mlのファルコンチューブに分離。追加のチューブが凍結し、後日使用することができます。

2。動物PreparatioN - 気管チューブの挿入

1. 気管チューブ（すなわち、鉗子、はさみ、気管チューブは3-0の黒い編み糸、小動物の人工呼吸器、等）の挿入のために必要な機器や材料でトレイを準備します。
2. ラットは1キシラジン〜2ケタミンの割合でケタミン/キシラジンカクテルと完全に麻酔になると、ラットの腹部、胸部、そして喉を削る。深い麻酔状態が達成されていることを保証するために、ラットのつま先をつまむと四肢のペダルの撤退を確認してください。ラットは、すべての切開を行う前に、深く麻酔であることを確認します。
3. 30 °の角度で傾斜したまな板の上上げ、その頭を持つネズミを配置
4. 半ば腹部から下顎下に皮膚切開を行います。気管を露出させる前頸三角の筋を離れて解剖。
5. 気管の下に3から0黒い編み糸を置きます。
6. 軟骨環の間の気管の切開を加えますD気管チューブを挿入します。気管に気管チューブを固定するために緊密に縫合糸を結びます。
7. 小動物の人工呼吸器に気管チューブを接続します。

3。免疫細胞分離のための計器の準備

1. 免疫細胞の単離法のための機器（すなわち、鉗子、はさみ、HBSS、針クイックカテーテルを介してソフトテフロン24ゲージバクスター血管内をトリミング）してトレイを準備します。
2. two 10ccの注射器を準備し、心膜嚢と予備のセルを含むHBSSを吸引するためのもう一つのバッファを導入するためのHBSSを使用すると、ワンシリンジを埋める。

   3.2.1。分離の手続きのための元の長さの1 / 2〜3 / 4針クイックカテーテル（1.6センチ）以上の24ゲージバクスター血管内のテフロンチップを減らす。

3. すべての注射器、バッファ、および空の15 mLのファルコンチューブ（手続きが終了後、抽出液を保持するため）氷の上に置きます。

4。免疫細胞分離

1. あなたが剣状突起に到達するまで腹壁（白線に沿って）に正中切開を加えます。
2. 剣状突起にわずかに横方向の開始、腋窩に向かって斜めに継続的な胸郭を通じて二国間の切開を行います。肺、心臓、または心膜を穿孔しないように注意してください。
3. 胸骨の両側の切開が完了したら、内側の側面切削、下部肋骨からダイアフラムを離れて解剖。

   注意：心膜が損傷を避けるためにダイアフラムと胸骨に接続されている箇所の今まで注意してください。心膜はダイアフラムの反対側に接続されている場所に注意するランドマークとして、肝鎌状間膜を使用してください。心膜が切断された場合も、細胞を単離する能力は失われます。

4. ゆっくりと胸腔と心を（まだ心膜でカプセル化された）公開する胸郭の片側を持ち上げて。
5. HBSSにシリンジを取ると心膜嚢のポイントを見つける胸骨と心臓の間に約半分の方法を（好ましくは吻側尾側より）と心の両方の層を介し短縮クイックカテーテルのテフロンチップを挿入。
6. カテーテルを設置したら、HBBSバッファの2〜3mlで心膜腔を埋める優しく進んでください。あなたが心膜腔が拡大して気づいたときにカテーテルが適切に配置されている場合は、すぐにわかります。ない充填が目撃されていない場合は、クイックカテーテルを撤回し、再配置。
7. 心膜嚢がいっぱいになると、他の10 ccシリンジを取ると心に戻って先端を配置し、バッファーを吸引開始。同じエントリの穴を使用することができますまたは別のを作成することができます。特に心臓の下側に、吸引を提供しながら、先端は心膜嚢の壁に近すぎて来ていないことを確認してください。これは、細胞含有細胞の心膜嚢と損失を穿刺する可能性がありますS.
8. バッファーを吸引しながら、カテーテルの先端はできるだけ多くのバッファを収集するために、心膜の内部を移動することができます。

注：もしあなたが少し心を引き裂き、元の穴より大きい心臓の上部に穴を開けて、そうすることで、慌てる必要はありません。限り、心膜はまだ十分な心のを囲むようにあなたはまだバッファより少ない量ではあるが、心臓を経由して別の洗浄を行うことができます。細胞の最適な量のコレクションの場合、3〜4追加の洗浄が必要である。

9. 氷の上に配置されたファルコンチューブに抽出されたバッファに置きます。
10. さらなる研究のために必要な場合は心臓、肺、および/またはその他の組織を削除します。免疫細胞と他の組織の集まりの後、ラットは、迅速かつ人道的に安楽死でなければならない。
11. 4で200グラム℃で10分間のために収集された免疫細胞のサンプルを遠心常に氷上でチューブを保持しないときは、使用中である。
12. HycloneバッファまたはHBSSを1 mLの上清と再構成ペレットを取り外します。

注：免疫細胞の単離手順の後、各心臓から得られる免疫細胞の数をカウントすることが重要です。

5。代表的な結果：

トルイジンブルーおよびサフラニンO /アルシアンブルーで、この手法で染色を用いて得られた分離された心臓の肥満細胞の例はそれぞれ、図2Aおよび2Bに示されている。図3に、心臓のマストに見られるように、そのような化合物の80分の48とモーガンらに説明されているようにサブスタンスPとして知られている活性剤で処理した後にヒスタミンを放出する能力を維持した。CD4のフローサイトメトリーから⁹代表的な散布図+細胞はとCD8 +細胞は、それぞれ図4および図5で提示されています。 T -リンパ球は、さらにこの技術から細胞集団として同定と表現型されています。

心臓の免疫細胞の単離手順の図1。フローチャート。

トルイジン青（）と（B）サフラニンO /アルシアンブルーである： 図2心臓の肥満細胞の組織学的代表的なイメージは次のように染色されています。。

図3。心臓の肥満細胞の機能研究心外膜心筋部位から分離し、化合物80分の48（10μg/mL）およびサブスタンスP（10μM）で刺激した。

図4。分離されたCD4 +細胞のサブスタンスP（1:100 dilutで標識の代表的なフローサイトメトリーの散布図イオン）。

図5。サブスタンスP（1:100希釈）で標識単離したCD8 +細胞の代表的なフローサイトメトリー。

ディスカッション

心臓の免疫細胞を単離するこのメソッドは通常、伝統的な酵素消化の単離技術の間に発生する不要な活性化することなく、機能、表現型、および成熟度の分析を可能にします。この手法で得られた細胞の平均合計数は、ラットの心臓あたり約40万であり、そしてこれらの細胞の差の染色とフローサイトメトリー分析は、T -リンパ球の混合集団（〜70％）、マクロファージ（〜12％）と肥満細胞とを示しているこの技術の使用^{。（〜12％）13、}その^14は 、心臓の免疫細胞集団のさらなる分離のための精製法が必要とされています。単離された免疫細胞は、機能の研究、フローサイトメトリー、immunofluroescence、および共培養実験を含む複数のアプリケーションに使用することができます。さらに精製すると実験で、これらの単離された細胞は、心臓リモデリングの過程における免疫システムの役割を理解するための便利なツールを提供しています。

動物の安全性：

ラットは標準的な環境条件下で飼育し、商業ラット固形飼料および...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬と機器の名称	会社	カタログ番号	コメント
ハンクス平衡塩	シグマ	H4891	1本のボトルにはハンクスバランス塩の1 Lになります ソリューション。再構成ハンクスバランス塩 手順の一部としてソリューション。
抗生物質Antimyotic	GIBCO	15240-062
HEPES	シグマ	H3784
ウシ血清アルブミン	シグマ	A3912
250mLのNalogeneフィルターボトル	Thermoscientific	157-0020
12 N HCL	フィッシャーサイエンティフィック	CAS 7647-01-0	6 Nの場合は、脱イオンにHCLの同じボリュームを追加水。
10NのNaOH	フィッシャーサイエンティフィック	SC267	5 Nの場合は、脱イオン水に水酸化ナトリウムの等量を追加。
再蒸留水

特定の機器の表：

試薬と機器の名称	会社	カタログ番号	コメント
3 - O縫合シルク編組	エチコン製品	SA64H
小動物の人工呼吸器	CWE株式会社	SAR - 830	分あたり40.5呼吸する呼吸数を設定します。
ベベル18ゲージの針	BDバイオサイエンス	305199	気管チューブとして使用するための元の長さの1 / 2〜3 ​​/ 4針をトリミング。
24ゲージバクスタークイックカテーテルカテーテルのテフロンチップ（針を除去したもの）	バクスター	2N111	3 / 4〜1 / 2テフロンチップの長さを減らします。
10ccのシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	14から823 - 16B
15 mLのファルコンチューブ	BDバイオサイエンス	352097
ソーバルRT6000B冷却遠心機	フィッシャーサイエンティフィック	75-004-377	プレクールに覚えていると4で保つ℃、
Hyclone	Thermoscientific	S300030.02
血球計	Hausserサイエンティフィック	HS - LB - 1483