方法論記事

ヒトのインビトロ抑制

DOI：

10.3791/3071

⸱

2011年7月22日

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1Department of Pediatrics/Allergy, Medical College of Wisconsin , 2Flow Cytometry Core Facility, Medical College of Wisconsin , 3Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetes and Human Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin

この記事について

サマリー

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Tregsのは、免疫系の強力な抑制因子である。それ故に、それらを定義するためにユニークな表面マーカーの欠如が存在する、Tregsのの定義は、主に機能的です。ここでは、最適化を説明 in vitroでアッセイ。

要約

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制御性T細胞（Treg）は自己抗原に対する免疫寛容の重要なメディエーターである。さらに、彼らは感染後の免疫応答の重要な調節因子である。 Tregsの上でユニークな表面マーカーを同定するための努力にもかかわらず、唯一のユニークな特徴は、エフェクターT細胞の増殖や機能を抑制する能力です。それが唯一のin vitroアッセイにおいてヒトTregの機能を評価に使用される場合があることは明らかですが健康な細胞と細胞（1型糖尿- T1Dのような）自己免疫疾患を有する被験者から分離された横断的研究からの結果を評価する際に、これは問題となる必 ​​要があります。比較する。応答者の比率とのin vitro抑制アッセイにおけるヒトで使用されている抗原提示細胞（APC）の数と種類：レスポンダーT細胞、刺激の性質と強さ、Tregの数と種類の研究所の間で大きなばらつきがあります。この変動は、困難なTregの機能を測定する研究間の比較を行います。 Tregのフィールドには、健常者と自己免疫疾患患者の両方でうまく動作する標準化された抑制アッセイを必要とします。我々は、膵β細胞の自己免疫破壊の根底にあるの被験者に比べて健康なボランティアから単離したT細胞の刺激ではほとんどのイントラアッセイのばらつきを示すin vitroでの抑制アッセイで開発した。この作品の主な目的は、異なる被験者グループ間の比較を可能にするin vitroでヒトの抑制アッセイで記述することです。さらに、このアッセイは、このように予防的免疫療法の1から利益を得ることができる科目を識別する、機能をnTregに小さな損失を描くと、将来のさらなる損失を予測する可能性を秘めています。以下、我々は、この手順に必要な手順の徹底的な説明を提供しています。我々はTregの機能を測定するために使用されるin vitroでの抑制アッセイの標準化に貢献したいと考えています。さらに、我々は免疫不均衡の初期の状態とT1Dのための潜在的な機能のバイオマーカーを認識するツールとして、このアッセイを提供する。

プロトコル

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1。抑制アッセイを設定する前に、その後の細胞の刺激とするための抗ヒトCD3（クローンUCHT1、最終濃度1μg/mlの）でコーティングtosylactivatedビーズへの1つのニーズは、ビーズが効率的に人間を用いた in vitro増殖アッセイで設定することによって被覆されているかどうかを確認するT細胞

  1. オリジナルバイアル、磁気スタンドの場所からM - 450 tosylactivatedビーズを1mlを取り、すべてのビーズがチューブの側面に付着するまで押し続けます。チューブは、磁気スタンドに入れたままでバッファを削除します。 37、撹拌機を再懸濁しますビーズをbuffer1の1mlの抗ヒトCD3の40μlのを追加°、磁気スタンドからチューブを取り、buffer1の1mlを追加、再び磁気スタンドにチューブを配置し、チューブを磁気スタンドにある間buffer1を削除するC 15分間、0.1％w / vのBSAを追加し、次の16時間攪拌を続行。
  2. バッファを削除するとbuffer2の1mlのビーズを再懸濁さ;ビーズがある℃、一回5分間buffer3で2〜8℃上記で説明したように磁気スタンドを使用して2〜8℃で5分間二回buffer2でビーズを洗浄4 × 10 8 / mlの最終濃度、使用できるようになります。
  3. 分注し50,000 25000 PBMC /ウェル、96ウェルプレートでトリプリケートでとCD3でコーティングされ....

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ディスカッション

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Tregsのへの唯一のユニークな特徴として、抑制機能は、同じ内および異なる研究間の疾患の開発のさまざまな段階での被験者の間で確実にかつ均一にテストする必要があります。我々は、このアッセイの標準化への貢献として、当研究室で開発抑制アッセイの詳細を提供します。私たちの広範な最適化の研究では、我々は自然の刺激を提供するAPCとしてPBMCとの併用で抗ヒトCD3でコーティングされたビーズ（UCHT1クローン、1μg/mlの濃度で（のような市販の5μg/mlとは対照的に）とT細胞の刺激と判断したのみAncell抗体が期待される結果を与えた我々の手のように1抗ヒトCD3抗体の選択は、非常に重要である。同時抗ヒトCD3で刺激と抗がテストの被験者にもレスポンダーT細胞とTregsの両方を活性化することができるPBMCは、シグナル伝達と効率的な刺激のチャンスを増やすこと、共刺激シグナルの完全なパレットを提供しながら、ヒトCD28は、対象グループ（結果は示していない）との違いを検出するのに十分ではなかった。

このプロトコルはleukopacksと患者血液の両方で使用できます。唯.......

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開示事項

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利害の衝突は宣言されません。

謝辞

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この研究は、ウィスコンシン州とウィスコンシン州の子どもの研究所の少年Diabetesat医科大学のマックスマギー国立研究センターによってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析の役割、または原稿の準備がなかった。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬や器具の名前会社カタログ番号コメント（省略可能）
をFicoll - Paque PLUS アマシャムファルマシアバイオテク 17-1440-03
DPBS - 1X ギブコ 14190-144
トリパンブルーインビトロジェン 15250-061
抗CD4マイクロビーズ国内でのみ有効 130-045-101
プレセパレーションフィルター国内でのみ有効 130-041-407
LSカラム国内でのみ有効 130-042-401
EDTA インビトロジェン 15575-020
BSA シグマアルドリッチ B4287
抗ヒトCD4 - APCCy7（クローンRPA - T4） BD Pharmingen社 557852
抗ヒトCD25 - PE（クローンM - A251、IL -2Rα） BD Pharmingen社 555432
抗ヒトCD8 - FITC（クローンRPA - T8） BD Pharmingen社 555366
抗ヒトCD14 - FITC（クローンM5E2、LPSの受容体） BD Pharmingen社 555397
抗ヒトCD32 - FITC（クローンFLI8.26、FcγRのタイプII） BD Pharmingen社 555448
抗ヒトCD116 - FITC（クローンM5D12、GM -CSFRαチェーン） BD Pharmingen社 554532
Dynalbeads M - 450 tosylactivated インビトロジェン 140から13
抗ヒトCD3 Ancell 144から024
Buffer1 手作り 0.1MのNa 2 B 4 O 7 pH7.6
Buffer2 手作り PBS/2mM EDTA / 0.1％BSA pH7.4の
Buffer3 手作り 0.2M Tris/0.1％BSA pH8.5
完全RPMI培地手作り RPMI 1640培地2mM L -グルタミン、5mMのHEPES 100 U /μg/ mlのpeni / strept 0.5mMのピルビン酸ナトリウム
[3 H]チミジンパーキンエルマー NET027Z005MC
人間のプールされたAB血清アトランタバイオ S40110
マルチスクリーン収穫プレートミリポア MAHFC1H60
Microscint 20 パーキンエルマー 6013621

参考文献

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  1. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
  2. Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R.

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タグ

in vitroTregTCD4 T1

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