タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Summary

金の長鎖アルカンチオールから形成された自己組織化単分子層（SAM）は、蛋白質のパターンとセルの閉じ込めを形成するための明確に定義された基質を提供しています。ポリジメチルシロキサン（PDMS）グリコール終端アルカンチオールの単量体との埋め戻しに続いてスタンプを使用してhexadecanethiolのマイクロコンタクトプリンティングは、タンパク質や細胞の吸着のみスタンプhexadecanethiol地域にパターンを生成します。

Abstract

マイクロコンタクトプリンティングは、直接タンパク質^{、2 DNA、3、}シラン^、4自己の形成を含む分子の多数を、印刷するために採用できるが、マイクロコンタクトプリンティングは。明確に定義されたパターニング基板を作成するための迅速な、再現性の高い方法を提供する¹金の上に長鎖アルカンチオールの組織化単分子膜は、（SAM）が接着剤と抵抗性領域を含む特定のパターンにタンパク質および細胞を閉じ込める簡単な方法を提供します。この閉じ込めは、細胞形態を制御するために使用され、タンパク質や細胞生物学のさまざまな質問を調べるときに有用であることができる。ここで、我々は、細胞の研究のための明確に定義されたタンパク質のパターンを作成するための一般的な方法を説明します⁵このプロセスは3つの手順を実行します。。のフォトリソグラフィを用いたパターニングされたマスターの製造、PDMSスタンプの作成 ​​、およびマイクロコンタクトプリンティング金を、コー​​ティングされた基板。一度パターン化された、これらの細胞培養基板は閉じこめタンパク質および/またはパターンの細胞（プライマリーセルまたはセルの行）が可能です。

自己組織化単分子膜の化学の使用は、パターン化されたタンパク質/細胞接着領域と非接着領域を正確に制御することができますが、これは、直接タンパク質のスタンプを使用して達成することができます。 Hexadecanethiol、マイクロコンタクトプリンティングのステップで使用される長鎖アルカンチオールは、容易に解から蛋白質を吸着する疎水性表面を生成します。基板の非印刷領域を埋め戻しに使用されるグリコール終端チオールは、タンパク質吸着、したがって細胞増殖に耐性が単分子層を作成します^。6は、これらのチオール単量体が正確にサポートすることができる基板の領域を定義する高度に構造化された単分子膜を生成するタンパク質吸着と細胞増殖。その結果、これらの基板は、マイクロエレクトロニクスの創造に細胞間の動作⁷の研究から様々なアプリケーションに有用です^。8

単分子層の化学の他のタイプを直接ガラス基板上にパターンを作成するトリクロロシランを用いて我々のグループからの作業を含む細胞培養研究用に使用されているが、金にアルカンチオールから形成された⁹柄の単層は、準備にストレートフォワードです。また、単層の調製に用いられるモノマーは、安定して市販されており、不活性雰囲気下で保管または処理は必要ありません。アルカンチオールから調製したパターニングされた基質は、細胞の閉じ込めを維持し、数回のリサイクルおよび再利用することができます^。10

Protocol

1。パターンドマスター（図1）の調製

1. 中央スピンコーター上にシリコンウエハと表1の2サイクルのスピンプログラムの初期段階中に、アセトンでウェハをすすぐ。アセトンは清潔で乾燥したウェハを残しスピンプログラムの第二段階の間に蒸発する。
2. 表1に記載の条件を使用してウェハとスピンコートして約1 mLのAZ9245フォトレジスト/で（直径）適用されます。
3. ソフトベーク110でフォトレジストでコーティングされたウエハ·高均一性のホットプレートを使用して2メートルのためのC。
4. Photopatternどちら直接書き込みリソグラフィシステムやマスクアライナシステムと適切なマスクを用いて基板。マスクは商業的供給源の数から購入することができます。さらに、光学フラットに録音されたUV吸収剤、インク、、と印刷されたOHPフィルムは、大きな特徴でパターンを生成するために使用することができます。
5. 穏やかに撹拌で1メートル45秒のために半導体グレードの脱イオン水：1:2 400K開発者のパターン付きウェーハを開発する。半導体グレードの脱イオン水と窒素の流れ（N _2）ガスを用いたドライで十分にすすいでください。パターンの開発は、UVフィルターを顕微鏡を使って確認することができます。パターンが完全に開発されていない場合は、ウェハは、追加の時間のための現像液に戻すことができます。

注：....

Discussion

問題の数は、PDMSスタンプの作成に使用されるマスターのリソグラフィ製造で発生することができる。ぼんやりと不明瞭なパターンと拡大または欠落している機能は、レジストコートされたウェハの結果の露出過度のレジストコートされたウェハの結果の露出不足。小さな機能を持つマスターが光パターニングと開発のパラメータ（フォトレジストメーカーが推奨するパラメータを超えて）の広範な最適化を必要とすることができますが、一般的に、大きな特徴のサイズが（> 10ミクロン）を持つマスターは、パターンには比較的容易であり、開発する。大と小の両方の機能を組み合わせる生成するために最も困難なマスター。

マスターからPDMSスタンプの作製には、セクション2で説明した手順を使用して簡単です。しかし、完全にSylgard 182の2つのコンポーネントを混在させることに注意する必要があります。コンポーネントの完全な混合を達成するために障害が硬化スタンプとマスターの可能性破壊に無効になることがあります。過剰な力が使わまたはねじれが分離時に発生している場合PDMSスタンプからそれを分離するときにさらに、マスターが破損するこ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
シリコンウェハ	ウェハは、サービスを再利用		2インチ
スピンコーター/ホットプレート	ブリュワーサイエンス	シー200CBスピン=ベイクシステム
AZ9245フォトレジスト	メイズケミカルカンパニー	105880034-1160
直接書き込みリソグラフィシステム	マイクロテックSRL	LW325 LaserWriterのシステム
マスクアライナ	HTG	3時間
AZ 400K開発者	メイズケミカルカンパニー	105880018-1160
Sylgard 182シリコーンエラストマーキット	ダウコーニング
25mmのない。 1ラウンドガラス製カバースリップ	VWR	16004-310
プラズマ酸化剤	ディーナー	フェムト
チタン片カミス	組み込ま		99.95パーセント純粋な
ゴールドペレット	カミス株式会社		99.999パーセントの純粋な
電子ビーム蒸着	クルトJ. Lesker	PVD 75薄膜の成膜装置	電子ビームのアクセサリー付き
Hexadecanethiol	アルファAesar	A11362
1 - mercaptoundec - 11 -イル）テトラ（エチレングリコール）	シグマアルドリッチ	674508
エタノール	Pharmco - aaper	111000200	200プルーフ、絶対
パラフィルム	VWR	52858-000
DPBS	VWR	4500-434	カルシウムとマグネシウムを含まない
マウスラミニンI	VWR	95036-762
ヒト血漿フィブロネクチン	インビトロジェン	33016-015
AlexaFluor ® 647カルボン酸、スクシンイミジルエステル	インビトロジェン	- 20006
MitoTrackerによりレッド580	インビトロジェン	M22425
AlexaFluor ® 350カルボン酸、スクシンイミジルエステル	インビトロジェン	- 10168
抗ラミニン抗体	フィッシャーサイエンティフィック	AB2034MI