ケージド化合物の光分解は、様々な生理活性化合物の濃度の急激かつローカライズされた増加の生産を可能にする。ここでは、解離マウス嗅神経細胞における嗅覚情報伝達の研究のためのケージドcAMPまたはケージのCaの光分解を組み合わせたパッチクランプ記録を取得する方法を示します。
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この記事について
サマリー
要約
ケージド化合物の光分解は、様々な生理活性化合物1の濃度の急激かつローカライズされた増加の生産を可能にする。ケージド化合物は紫外光のフラッシュと壊れる可能性の化学ケージで生理的に非アクティブに分子である。ここでは、解離マウス嗅神経細胞における嗅覚情報伝達の研究のためのケージド化合物の光分解を組み合わせたパッチクランプ記録を取得する方法を示します。嗅覚情報伝達のプロセス（図1）の受容体に結合する嗅覚は、環状ヌクレオチド依存性（CNG）チャネル2を開くcAMPの増加につながる嗅神経細胞の繊毛で行われます。 CNGチャネルを通じて、CAエントリは、Ca活性化塩素チャネルを活性化する。我々は、マウス嗅上皮3、どのようにケージキャンプ4の光分解またはCa 5をケージでCNGチャネルまたはCa活性化塩素チャネルを活性化するから神経細胞を分離する方法を示しています</>のSup。我々は、パッチクランプ記録をホールセル電圧クランプの設定8-11の電流を測定するために取られている間、おりから出すのcAMPやCaに毛様体部分に紫外線が点滅を適用するにはフラッシュランプ6,7を使用してください。
プロトコル
1. 使用機器
- ケージド化合物の光分解に対する嗅覚感覚ニューロンの応答を測定するために、以下の装置を含む標準的なパッチクランプ記録システムとフラッシュランプを併用します：パッチクランプ増幅器、記録電極、増幅器のヘッドステージに接続された参照電極、ディジタイザー、コンピュータ、データ収集ソフトウェア、マイクロマニピュレーター、エピ蛍光顕微鏡、灌流システム、除振台、およびファラデーケージ（図2）。
- 高強度の紫外線（UV）フラッシュを発生させるために、キセノンガスを満たした短弧フラッシュチューブに高電圧コンデンサを放電させる仕組みのキセノンフラッシュランプ（Rapp OptoElectronic JML-C2 Flash Unit、図3A）を使用します6-7。フラッシュ光は、手動または、電気生理学的データ収集を制御するのと同じソフトウェアを用いてコンピュータ経由でトリガーできます。
- 脱ケージング用途に最適化されたUVショートパスフィルター（270-390 nm）をフラッシュランプの出力スロットに挿入し、石英ファイバー光導波路を顕微鏡に接続します（1.5参照）。
- フラッシュ光の強度、したがって光分解の程度は、特定のパラメータを変更することで調整可能です：
電圧または静電容量6。実際、光強度はコンデンサに蓄えられたエネルギーに関連しており、標準的な関係式 0.5 CV2に従い、静電容量の値とそれに加わる電圧に依存します。フラッシュランプのフロントパネルで3つの静電容量値（C1=1000 μF、C2=2000 μF、またはC3=3000 μF）から1つを選択でき、電圧は100〜385 Voltsの間で変更可能であり（図3A）、5〜220 Jの蓄積エネルギーを生成します。フラッシュ持続時間は、半値全幅で0.5〜1 msであり、選択した静電容量値に依存します。異なる静電容量を選択したり、電圧をより低い値に設定したりする前に、フラッシュランプのフロントパネルで放電モードを選択し、コンデンサを放電させる必要があります（図3A）。
ただし、電気エネルギーが増加するにつれて、ガス放電の物理的特性や回路内の非線形損失など多くの要因があるため、光エネルギーは蓄積エネルギーに単純に比例しません6。フラッシュ光に伴うエネルギーを測定するには、Rapp OptoElectronics社製のJM10などのジュールメーターを使用できます。Rapp OptoElectronic Flash Unitのユーザーガイドに記載されている通り、UVフィルターを装着した石英光導波路の出口におけるエネルギーは、1回あたりのフラッシュにつき1-15 mJの範囲内です。
フラッシュランプユニットに付属のフォトダイオードアセンブリ（図3B）を使用すると、CおよびVの関数としての光強度の変動を推定できます。実際、フォトダイオードの出力は光強度に比例します。ユーザーガイドの指示に従い、光導波路をフォトダイオードアセンブリの入力に接続し、出力をオシロスコープに接続します。図3Cは、本装置で使用可能な3つの静電容量値（C1、C2、またはC3）における、印加電圧に対するフォトダイオードのピーク出力電圧を示しています。これらの値は、フラッシュ電球が劣化するにつれて変化します。フォトダイオードを用いて定期的に電球の劣化を確認することが推奨されます。
フロントパネルで静電容量や電圧を変更する代わりに、フラッシュランプの2番目のフィルタースロットにニュートラル密度（ND）フィルターを配置することで、より精密かつ迅速な光強度の制御が可能です（図3A）。この手法はより迅速であり、さらに、選択した静電容量値に依存するフラッシュ持続時間を変更せずに済みます。透過率100%から0.1%までのNDフィルターを使用することで、フラッシュ強度を広範囲にわたって迅速に調整できます。 - フラッシュ光は、石英ファイバー光導波路を通じて、ガラス底ディッシュに播種されたニューロンに照射されます（図2）。光導波路はアダプターを用いて倒立顕微鏡のエピ蛍光アタッチメントに接続されます。励起フィルターのない改造フィルターキューブにより、UVビームがダイクロイックミラーを介してニューロンに導かれます。
- 光は100x油浸対物レンズを通して集光されます。フラッシュがカバーする領域を視認するため、可視光の連続光源を提供する照明装置に光導波路を挿入します。画像（ビデオ内では黄色で表示）は、顕微鏡に接続されたCCDカメラを介してモニターで確認します。実験のためにUVフラッシュ領域を特定するため、照射領域の輪郭をモニター上に描きます。UVフラッシュを照射する前に、ニューロンの繊毛領域をモニター上に描いた領域内に移動させます。
- UVスポットのサイズは、対物レンズの倍率、光導波路の直径、および顕微鏡背面での光導波路の位置によって制御されます。本手順では100x油浸対物レンズを使用します。円形スポットの直径は、照明装置からの光を顕微鏡ステージ上のマイクロメータースライドに照射して測定します。本装置において、光導波路の直径がそれぞれ200、400, 600、または1250 μmの場合、スポット直径は約16、33、50、または105 μmとなります。
2. 溶液の調製
解剖
- リンゲル液：140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM sodium pyruvate（1M NaOHでpH 7.4に調整）。
- ストップミックス溶液：0.1 mg/ml BSA, 0.3 mg/ml leupeptin, および 0.02 mg/ml DNaseIを含むリンゲル液。
- 二価陽イオン不含リンゲル液：140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM glucose, 1 mM sodium pyruvate（1M NaOHでpH 7.4に調整）。酵素的解離用に 200 μM cysteine と 2 U/ml papain を添加する。
注：解剖に使用する溶液は、ステリルフイルターを用いてろ過すること。
パッチクランプ記録溶液
細胞外液
- 細胞外リンゲル液：140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM sodium pyruvate（1M NaOHでpH 7.4に調整）。
- 低Caリンゲル液：140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM sodium pyruvate（1M NaOHでpH 7.4に調整）。
細胞内液
ケージ化合物の溶液を調製および使用する際は、周囲の光によるケージ化合物の分解を避けるため、常に暗所で作業してください。容器はアルミホイルを使用して遮光してください。
ケージドcAMP：
- 145 mM KCl、4 mM MgCl2、0.5 mM EGTA、10 mM HEPES、1 mM MgATP、および0.1 mM NaGTPを含む細胞内液を調製する（1M KOHを用いてpH 7.4に調整する）。
- ケージドcAMP（BCMCM-cAMP4）をDMSOに溶解し、50 mMのストック溶液を調製する。5 μlずつ分注し、-20°Cで最大1年間保存する。
- ケージドcAMPストック溶液の分注量を細胞内液に溶解し、ケージドcAMPの最終濃度を50 μMにする。ボルテックスミキサーで混合する。
- ケージドcAMP含有細胞内液を1 mlずつ分注し、使用まで-20°Cで最大2ヶ月間保存する。
ケージドCa:
1.5 mM Caを50%充填した3 mM DMNP-EDTA5を含む細胞内液を調製します。
- 140 mM KCl（またはCsCl）、10 mM HEPES（1M KOHまたはCsOHでpH 7.4に調整）を含む細胞内液を調製する。
- 5 mg DMNP-EDTAのバイアルを開封する。0.1 M塩化カルシウム標準溶液52.8 μlと細胞内液1 mlを加え、ボルテックスで混合する。
- 周囲の光によるケージドCaの脱ケージングを防ぐため、溶液をアルミホイルで遮光したチューブに移す。最終容量が3.5 mlになるまで細胞内液を加える。ボルテックスで混合する。ケージドCa含有細胞内液を約1 mlずつ分注し、使用時まで-20°Cで最大2ヶ月間保存する。
注意点：実験中は、ケージ化合物の溶液をアルミホイルで遮光し、氷上で保持してください。 細胞内液は滅菌フィルターを用いてろ過してください。
3. マウス嗅覚感覚ニューロンの解離
動物の取り扱いは、イタリアの実験動物使用ガイドライン（Decreto Legislativo 27/01/1992, no. 116）および欧州連合の動物研究ガイドライン（No. 86/609/EEC）に従って行われました。
- 10 mg/mlのコンカナバリンAおよび10 mg/mlのポリ-L-リジンでコーティングした、ガラスボトムディッシュを3枚準備する。
- 解剖の準備として、二価陽イオン不含リンガー液を1 ml準備する。50 mmのSylgardコーティング済みペトリ皿2枚にリンガー液を満たし、氷上に置く。また、パパイン-システイン混合液、0.5 mlのストップミックス溶液、および約10 mlのリンガー液を入れた0.22 μmフィルター付きシリンジを冷却しておく。
- マウスをCO2による安楽死させた後、断頭させる。頭蓋骨上の皮膚を取り除き、顎のラインに沿って切開し、頭部をSylgardコーティング済みのペトリ皿に入れる。
- ディッシュを実体顕微鏡の下に置く。メスを用いて、正中線に沿って頭部を正中矢状面に二等分する。頭部の半分を内側が上になるように向ける。中隔を慎重に取り除き、鼻甲介を露出させる（Cygnar et al., 201013も参照）。
- 3番ピンセットとメスを用いて、嗅上皮が裏打ちされた鼻甲介を取り出す。Sylgardコーティング済みのペトリ皿に移す。
- 55番スーパーファインピンセットを用いて、嗅上皮の断片を付着している鼻甲介部分から分離する。これらを1 mlの二価陽イオン不含リンガー液を含むチューブに移す。パパインおよびシステイン混合液を加える。マイクロシザースを用いて上皮を細かく刻み、室温で3分間インキュベートする。再度マイクロシザースで穏やかに刻み、さらに5分間待機する。
- 火炎研磨したパステールピペットを用いて、0.5 mlのストップミックス溶液を含むチューブに移す。
- 300 g (1500 RPM)で5分間遠心分離する。上清を捨て、ろ過したリンガー液を約1 ml加える。火炎研磨したパステールピペットを用いて穏やかに撹拌（トリチュレーション）する。
- 細胞を含む溶液約0.3 mlを、3枚のガラスボトムディッシュの中心に播種する。+4°Cで約1時間、細胞を静置させる。その後、リンガー液を加える。
4. 記録
- ホウケイ酸ガラスキャピラリーを用いてパッチピペットを作製し、細胞内液を充填した状態で3-7 MΩの抵抗値になるように調整する。
- 解離させた嗅覚感覚ニューロンを含むガラス底皿を倒立顕微鏡のステージ上に設置する。リンガー液で灌流を行う。
- ケージ化合物を含む細胞内液を入れたシリンジをアルミホイルで遮光し、冷蔵保存する。周囲の光によるケージ化合物の分解を防ぐため、暗い環境下で作業を行う。
- 100倍の倍率で、繊毛が維持されている単離嗅覚感覚ニューロンを探す。顕微鏡ステージを移動させ、あらかじめ特定したUVフラッシュ照射領域にあたるモニター上の円内に繊毛領域が位置するように調整する。
- フレキシブルニードルを用いて、ケージ化合物を含む細胞内液をパッチピペットに充填する。ピペット先端から気泡を除去する。パッチクランプアンプのヘッドステージにあるホルダーにピペットを装着する。マイクロマニピュレーターを用いてニューロンの細胞体へ近づけ、緩やかに吸引してギガオームシールを形成する。電圧を-60 mVに設定し、標準的なパッチクランプ法12に従ってさらに吸引し、ホールセルモードにする。
- ケージ化合物が繊毛内に拡散するまで、少なくとも2分間待機する。
- コンピュータ上で刺激プロトコルを開始し、応答を記録する。低域通過フィルタを1 kHzに設定し、2 kHz以上のサンプリング周波数でデジタル化する。
- 代表的な刺激プロトコルでは、電圧を一定値に保持（クランプ）し、フラッシュランプからUVフラッシュを照射して、繊毛領域にあるケージ化合物を光分解させる。
5. 代表的な結果：
単離した嗅覚感覚ニューロンの繊毛領域において、ケージドcAMPまたはケージドCaの局所的な脱ケージングを行い、ホールセル電圧クランプ構成で電流応答を記録できるはずです。
図4は、低Ca Ringer液を細胞外に用いて-60 mVの電位で記録した、caged cAMPの光分解を引き起こすUVフラッシュによって誘発された典型的な内向き電流を示しています。この条件下での内向き電流は、CNGチャネルを介したNaの流入によるものです。電流の立ち上がり相は速く、時定数3.4 msの単一指数関数で近似されました。
図5A-Bは、低Ca溶液および1mM Caを含むリンガー液における別の嗅細胞感覚ニューロンの応答を示しています。-60 mVにおける電流の立ち上がり相は大幅に遅くなり、多相性となりました（図5 A-B）。これは、CaがCNGチャネルを通じて繊毛に流入し、二次的なCl電流を活性化するためです10。CNGの活性化による初期のカチオン電流成分は、1mM Caリンガー液では、透過するCaイオンによるブロックが全体の電流を減少させるため、低Ca溶液の場合よりも小さくなります。
繊毛内におけるCaの増加を抑制するもう一つの方法は、ニューロンを+60 mVでクランプすることです（図5 C-D）。+60 mVでのcAMPアンケージングによる応答の立ち上がり相は、時定数6.7 msの単一指数関数で良好に記述され、単一の電流成分のみが存在することが示されました。
嗅覚感覚ニューロンの繊毛内でCaを光放出させることにより、急速に上昇する電流を測定できるはずです。この電流はClイオンによって運ばれます。図6 Aは、異なる強度のUVフラッシュに応答してケージドCaを光放出させた際に、-50 mVで誘導された内向き電流を示しています。Ca活性化Cl電流の上昇相は、3.8から5 msの範囲で変化する時定数を持つ単一指数関数によって良好に記述されました（図6 B）。
図1. 嗅覚受容神経細胞の繊毛における嗅覚伝達。 odorant分子が嗅覚受容体（OR）に結合すると、Gタンパク質が活性化され、それがさらにアデニル酸シクラーゼ（ACIII）を活性化して、細胞内のcAMPを増加させる。cAMPは環状ヌクレオチド作動性（CNG）チャネルを開き、NaおよびCaイオンの流入を可能にする。細胞内Caの増加は、Ca活性化Clチャネルを活性化する。ケージドcAMPまたはケージドCaは、パッチピペットを通じて拡散させ、繊毛内に導入することができる。UV光のフラッシュにより、ケージド化合物の光分解が起こる（Pifferi et al. 20062より改変、許可を得て掲載）。
図 2. パッチクランプ記録およびフラッシュ光分解システム。セットアップ構成要素には、パッチクランプアンプ、コンピュータ、デジタイザ、エピ蛍光顕微鏡、キセノンフラッシュランプ、CCDカメラ、およびモニターが含まれる。青色と紫色の線は、それぞれ可視光とUV光の光路を示す。
図3. キセノンフラッシュランプ。 (A) ケージ化合物（caged compounds）のフラッシュ光分解に使用した光源。(B) フラッシュ光の強度を評価するために使用したフォトダイオードモジュール。(C) フラッシュランプからのライトガイドをフォトダイオードの入力端に接続し、出力をオシロスコープで可視化した。フラッシュランプのフロントパネルスイッチで3つの容量値（C1、C2、またはC3）のいずれかを選択し、フロントパネルのノブを回して電圧を変化させた。異なるフラッシュ強度に対するフォトダイオードからの出力電圧を、各容量値（C1 = 1000 μF、C2 = 2000 μF、またはC3 = 3000 μF）に対する印加電圧に対してプロットした。直径 600 μm のライトガイドを使用した。
図 4. 低細胞外Ca溶液中におけるcaged cAMPの光分解に対するパッチクランプ記録。(A) 繊毛に局在させたcaged cAMPの光分解によって、単離嗅覚感覚ニューロンに誘導されたホールセル電流応答。矢印で示した時点でUVフラッシュを照射した。保持電位は-60 mVであった。(B) 電流の立ち上がり相は、時定数3.4 msの単一指数関数（点線）で良好に近似された。
図5. 低Ca溶液およびリンガー液中におけるケージドcAMPの光分解によって誘導された電流応答。 (A) 嗅覚感覚ニューロンを、1 mM Caを含むリンガー液または低Ca溶液中で、保持電位-60 mVで浸漬させた。矢印で示すタイミングでUVフラッシュを照射した。(B) 時間軸を拡大してプロットした電流応答では、リンガー液中では多相性の立ち上がり相を示したが、低Ca溶液中で記録された応答の立ち上がり相は、時定数3.5 msの単一指数関数（点線）で良好に近似された。(C) (A)と同じニューロンをリンガー液に浸漬し、保持電位-60 mVおよび+60 mVで測定した電流応答。(D) 時間軸を拡大してプロットした電流応答では、-60 mVでは多相性の立ち上がり相を示したが、+60 mVでは立ち上がり相が時定数6.7 msの単一指数関数（点線）で良好に近似された。
図6. ケージドCaの光分解に対する応答。 (A) -50 mVにおけるケージドCaの光分解によって誘発されたホールセル電流。UVフラッシュは矢印で示したタイミングで照射した。フラッシュ強度は NDフィルターを用いて変化させた。(B) 拡大した時間軸により、Caの光放出後の急速な電流増加が示されている。電流は単一指数関数（点線）で良好にフィッティングされ、時定数は 5, 4.8, 3.8 msであった。(Boccaccio & Menini, 200710より許可を得て転載)。
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ディスカッション
パッチクランプ記録と組み合わせケージド化合物のフラッシュの光分解は、生理活性分子の濃度の内側と外側の細胞の両方の急激かつ局所ジャンプを取得するために便利なテクニックです。ケージcompounds1のいくつかの種類が合成され、そしてこの技術は、アクティブまたは利用可能なケージド化合物11のいくつかの光分解によって変調することができるイオンチャネルを発現する培養細胞など、様々なタイプに適用することができます。
ケージド化合物の光分解は短時間での分子の十分な量を刑務所から出すために近紫外光の高強度のパルスを必要とします。連続運転水銀やキセノンアークランプシャッターで制御し、顕微鏡の落射蛍光ポート、キセノンフラッシュランプ、UVレーザに結合し、そして最近開発された高出力の紫外線発光ダイオード（LED：様々な光源を使用することができます。 ）。光源の種類によって、それぞれ長所と短所を持っています特定のアプリケーションに、装置のコストに応じて利点とし。フラッシュランプと比較して、連続的に作動ランプが低い光強度を持っているため、シャッターで制御される光パルスの持続時間はun...
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 機器の | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 顕微鏡にアダプターモジュールフラッシュランプ | ラップオプトエレクトロニクス | フラッシュキューブ70 | |
| 空気テーブル | TMC | MICRO - G 63から534 | |
| デジタイザー | 軸索インスツルメンツ | Digidata 1322A | |
| データ収集ソフトウェア | 軸索インスツルメンツ | pClamp 8 | |
| データ解析ソフトウェア | WaveMetrics社 | イゴール | |
| アダプタモジュールのためのミラー | ラップオプトエレクトロニクス | M70/100 | |
| 電極ホルダー | 軸索インスツルメンツ | 1 - HL - U | |
| ファラデーのかご | カスタムは行わ | ||
| フィルターキューブ | オリンポス | U - MWU | 励起フィルターは削除 |
| フラッシュランプ | ラップオプトエレクトロニクス | JML - C2 | |
| 鉗子デュモン＃55 | 世界の精密機器 | 14099 | |
| ガラスキャピラリー | 世界の精密機器 | PG10165 - 4 | |
| ガラスボトムディッシュ | 世界の精密機器 | FD35 - 100 | |
| 照明器 | オリンポス | ハイライト3100 | |
| 倒立顕微鏡 | オリンポス | IX70 | |
| マイクロマニピュレータ | Luigs＆ノイマン | SM I | |
| マイクロピペットプラー | ナリシゲ | PP - 830 | |
| モニタ | HesaVision | MTB - 01 | |
| NDフィルター | オメガオプティカル | 変化 | |
| 客観100X | ツァイス | Fluar 440285 | ツァイスやOlympuのどちらかの |
| 客観100X | オリンポス | UPLFLN 100XOI2 | ツァイスやオリンパスのどちらか |
| 光学UVショートパスフィルター | ラップオプトエレクトロニクス | SP400 | |
| パッチクランプアンプ | 軸索インスツルメンツ | Axopatch 200B | |
| フォトダイオードの組立 | ラップオプトエレクトロニクス | PDA | |
| 石英ライトガイド | ラップオプトエレクトロニクス | 変化 | 我々は、600μmの直径を使用してください |
| 銀線 | 世界の精密機器 | AGT1025 | |
| シルバーグランドペレット | ワーナーの楽器 | 64から1309 | |
| キセノンアーク燈 | ラップオプトエレクトロニクス | XBL - JML |
| 試薬 | 会社 | カタログ番号 |
|---|---|---|
| BCMCM -ケージドcAMPの | BioLog | B016 |
| ウシ血清アルブミン（BSA） | シグマ | A8806 |
| 塩化カルシウム標準液0.1 M | フルカ | 21059 |
| ケージのCa：DMNP - EDTA | インビトロジェン | D6814 |
| システイン | シグマ | C9768 |
| コンカナバリンタイプV（ConA） | シグマ | C7275 |
| 塩化セシウム | シグマ | C4036 |
| DMSO | シグマ | D8418 |
| DNアーゼI | シグマ | D4527 |
| EDTA | シグマ | E9884 |
| EGTA | シグマ | E4378 |
| グルコース | シグマ | G5767 |
| HEPES | シグマ | H3375 |
| 塩化カリウム | シグマ | P3911 |
| KOH | シグマ | P1767 |
| ロイペプチン | シグマ | L0649 |
| MgCl2を | フルカ | 63020 |
| パパイン | シグマ | P3125 |
| ポリ- L -リジン | シグマ | P1274 |
| NaClを | シグマ | S9888 |
| NaOHで | シグマ | S5881 |
| NaPyruvate | シグマ | P2256 |
参考文献
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- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
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