大動物モデルにおける心血管デバイス用自家血管内皮前駆細胞播種技術と生体適合性試験

サマリー

自己細胞とテスト生体適合性とチタンの血液接触生体材料をシードする方法について説明する。このメソッドは、ブタ静脈cavaeに外科的に移植後数分以内に接種した内皮前駆細胞およびチタンチューブを、使用しています。この手法は、他の多くの埋め込み型医用機器に適応可能です。

要約

植込み型心血管系デバイスは、血栓の形成^1,2,3のリスクをもたらす人工材料（例えばチタン（Ti）、ポリテトラフルオロエチレン拡大）、から製造されています。我々は、自己血由来のヒトまたはブタ血管内皮前駆細胞^（EPC）4にチタンチューブの内側表面を整列する方法を開発した。豚の下大静脈（IVC）においてブタのEPCのコンフルエント層を含むチタンチューブを注入することにより、我々は、大規模なモデル動物の血栓環境における細胞播種面の改善された生体適合性をテストし、変更されていない裸の金属表面とそれを比較^5,6,7（ 図1）。このメソッドは、注入から数分以内にデバイスをendothelialize および in vivo でその抗血栓機能をテストするために使用することができます。

末梢血は、50キロヨークシャー豚とEPCは^4,8を分離するために培養したその単核細胞分画から得られた。チタンチューブ（9.4 mmのID）には3つの4.5センチメートル縦断面にあらかじめカットし、熱収縮チューブで再組み立てされた。シードデバイスは、チタン管の遅い回転を可能になる、建設された。

我々は、豚に開腹術を行い、腸や膀胱を外部化。シャープと鈍的切開は近右腎動脈の遠位の分岐からIVCを骸骨にするために使用されていました。チタンチューブは、均一な細胞コーティング^9を達成するために10 RPH × 30分でEPCサスペンションと回転自家蛍光標識に満ちていた。 100 USP / kgのヘパリンの投与後、IVCと腰静脈の両端をクランプした。 4cmのveinotomyが行われ、デバイスが挿入され、リン酸緩衝生理食塩水で満たされた。 veinotomyが4から0 Prolene実行されている縫合糸で閉じていたとして、あるクランプは解除空気IVCに削除されました。プロシージャの最後で、筋膜が0 - PDS（ポリジオキサノン縫合）で近似された、皮下のスペースは2-0 Vicrylで閉じ、皮膚が閉じホチキス。

3の後に - 21日、豚は、専用バスブロックと固定を植デバイス安楽死させた。チタンチューブは分解し、内部表面は、蛍光顕微鏡で画像化した。

我々は、EPC -シードチューブが特許残ったのに対し、裸の金属Ti管が完全に閉塞ことがわかった。さらに、我々は内部の血液接触面にEPCのコンフルエントな層を示すことができた。

おわり、私たちの技術は、デバイスの血栓症を防ぐために、自家EPCSに注入から数分以内にチタンチューブをendothelializeするために使用することができます。私たちの外科的方法は、最小限の失血とEPC -シードの表面の中断はそのような変更されたデバイスの改良された生体適合性をテストすることができます。

プロトコル

1。内皮前駆細胞の分離

1. 前のEPC -シードチューブの注入から30日間は、抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液15mlで60mlの注射器を準備し、末梢豚の血液からEPC分離のための3ウェイストップコックで固定します。前の採血から24時間、プレコートタイプ1ラットのコラーゲンと2つの12ウェルプレート（50μg/ mlの、0.02 N酢酸溶液に溶解した^）4。
2. 実験動物の管理と利用のための健康ガイドラインの国立研究所に従い、かつ、唯一の監督機関動物実験委員会の承認後にすべての動物の世話と実験を実施する。
3. 19 G蝶の針を介してアセプロマジン（1.1 mg / kg体重）とケタミン（22 mg / kg）を筋肉内で落ち着いた女性ヨークシャーブタ（45キロ）。
4. 気管内チューブ（30 cmの長さ、内径8mm）で豚を挿管し、（マスクによる換気量の4.5％）イソフルランで豚を麻酔。
5. 酸素飽和度、心拍数と温度を測定することにより、手順の間に豚を監視します。自動化された加熱された手術台と加熱毛布を使用し、注入液を温めることによって体温調節を維持する。
6. 手術台の上に仰臥位で豚を置き、caudolaterallyその後肢を固定し、そしてDuraPrep滅菌が続くクロルヘキシジンできれい。その後、骨盤領域をドレープに進みます。
7. 大腿静脈に触知大腿パルス（内側広筋の内側と薄筋の外側）にちょうど内側5 Fマイクロイントロデューサキット21からG × 7 cmの針を挿入し、Seldinger法を用いて静脈をカニューレを挿入する。血管内カテーテルに準備60mlのシリンジを接続し、血液の45 mlを描く。
8. 止血（5分）を達成するために血管穿刺部位への圧力を保持し、麻酔を中止し、豚を回復する。動物は完全に回復するまで監視し、そのケージに戻されます。
9. 血液ソリューションハンクスバッファ塩溶液と1:1（のCaCl _{2、MgCl 2を} 、MgSO _4を除く）と明確に定義されたレイヤーを作成するためにHistopaqueの同じボリューム上に層を希釈する。遠心分離（30分、740グラム、低ブレークの設定）と単核細胞（MNC）層を収集する。ダルベッコのリン酸で再懸濁し、洗浄多国籍企業× 3は完全増殖培地で2つの12ウェルプレート（EBM - 2 2％ブタ血清（PS）およびEGM - 2培地にプレーティングする前に（10分、515グラム）（DPBS）緩衝生理食塩水37 SingleQuots）° C、5％CO _2。
10. ゆっくりして最初の7日間、一日おきに24時間ごとに培地交換。平均時間後のEPCコロニーを識別する
    の7日間（ 図2）。
11. 彼らは12ウェルの表面積の¼をカバーしたら文化のEPCを展開します。表面マーカーCD31とCD14の欠如の存在をテストしてフローサイトメトリーによるEPCのアイデンティティ、CD45を確認してください。実行することができる他のアッセイは、フロー⁴への曝露後の細胞の形態と窒素酸化物III活性が含まれています。

2。チタンチューブアセンブリ

1. HHSは、スリット72の歯と3等しい120度の単位（4.5センチ）に長手方向にセクションチタンチューブは縦フライス盤で見たあずまやで固定されていた。 300rpmでそれを実行し、タップマジックカット中にすべての回で切削液（ 図3）で飽和した切削領域を保持します。
2. 卓上グラインダーとスコッチブライトの金属加工ホイールで内面を磨く。その後、さらに滑らかで、表面に3Mエメリー布で手動で磨くには、表示可能なすべてのピットを削除する。
3. 。水¹⁰数リットルで洗浄が続く王水（濃塩酸1:3濃硝酸）の水没5分、続いてAlconox石鹸溶液とチタンの部分を、きれいに王水は、腐食性の高い場合のように細心の注意を払ってくださいと潜在的に爆発！
4. 超音波処理Tiのセクションでは、Alconox石鹸の溶液中で× 16分、脱イオン水で× 30を上昇し、再び脱イオン水で× 16分を超音波処理してください。層流フード内で乾燥することができます。
5. 4.5センチメートルの長さと2.4％徹底的にきれいにカットPVC熱収縮チューブ。
6. 支持マンドレル（アルミ、8.5 mm外径から加工）とTiのセクションの周りPVC熱収縮チューブ（ 図4）の代わりにスリーブに3清浄Tiのセクションを配置するためにピンセットを使用してください。均等にしっかりと一緒にTiのセクションをラップするためにマンドレルを回しながらヒートガンで収縮チューブ。

3。シードデバイスとコンポーネントのアセンブリ

1. 2.5センチメートルおよび3.5 cmの長さにシリコンチューブをカット。
2. 第5節CC 0.8mlのマークでプラスチックシリンジとルアー終了と"ヘッドピース"してください。
3. 2 ×シリコーンセクション、シリンジ"ヘッドピース"と2.4で説明されているように超音波処理によってルアーキャップを徹底的に清掃してください。
4. エクステン、2.5から組み立てられたチタン管の各端にシリコンチューブを追加PVCチューブも5 mmだけ鼎。
5. それはチタンチューブ（ 図5）を接するように、短いシリコンチューブにシリンジ"ヘッドピース"の端をカット挿入します。
6. シールは、タイベックのポーチとエチレンオキサイド（55℃18時間℃）でガス滅菌の1つのルアーキャップとチタンチューブアセンブリを終えた。
7. プレキシガラスのプラットフォームに同期タイミングモータ（10 RPH）をマウントし、シリンジホルダー（アルミから削り、5 ccシリンジに適合）（ 図6）に、その車軸を接続する。

4。チタンチューブ内面のEPC播種

1. 1の下で単離されたEPCを展開しますコンフルエントT - 75フラスコ（または少なくとも9 × 10 ⁶細胞）に。
2. 手術当日に、長期的な色素と蛍光標識細胞^{（PKH26）11。}無血清培地中で二回培養EPCを洗浄することから始めます。ラベリングの実行中と実行後の細胞を保護するために、光の露出を制限するため注意。
3. 4分間室温で希釈Cの4μMPKH26（色素溶液）で細胞をカバーする。
4. ソリューションを染めるために、等量のブタ血清を添加することによりラベリング反応を停止します。一分後、完全増殖培地と組み合わせたソリューション1:1希釈。
5. 液体を吸引し、完全増殖培地で細胞× 3をすすいでください。
6. （のCaCl _{2、MgCl 2を}除く）二回DPBSでEPCを洗う。
7. 37℃でトリプシンとインキュベートのセルをカバーする3分​​間と、光学顕微鏡下で剥離を確認してください。使用されるトリプシンの二重量のトリプシン中和溶液を加える。
8. ピペッティングにより単管とのミックスに、セルのソリューションを組み合わせる。カウントのための血球計算板の両側に細胞溶液10μlを添加します。
9. 遠心分離セルソリューション（1500 RPH、5分）。 2で細胞ペレットを再懸濁しますを数える- 2.5 × 10 ⁶ [kW / mlの無血清培地中で。チューブアセンブリは4.5 mlの埋めるために最小音量に注意してください。
10. 無菌フィールドのための生物学的なフード内で無菌タオルをレイアウト。オープン滅菌フィールド上にチタン管アセンブリと余分な5 ccシリンジガス滅菌。
11. 滅菌手袋で、5 ccシリンジからプランジャーを取り外し、後で使用するためにフィールドにしてください。この注射器に貼ってルアーキャップ。
12. ピペットで4.5 -オープンシリンジバレルに4.9の下に5ミリリットルEPCサスペンション。安全に戻ってシリンジの開放端にプランジャーを挿入します。
13. 上向きのキャップでシリンジを持ち、キャップを取り外します。チタンチューブ内に進んでいない。ぴったりまでチタン管アセンブリのオープンシリコンチューブへの最初のルアーの端にシリンジを挿入します。
14. アドバンスシリンジプランジャが徐々に細胞溶液は、システムから気泡を除去する"、ヘッドピース"カットシリンジの上部に達するまで。ルアーキャップを閉めて、テープで開放端を密封、滅菌シースにアセンブリ全体を挿入します。
15. 3.7機械加工されたシリンジホルダーにこのアセンブリ全体を挿入します。 37℃インキュベーターで場所℃、播種チャンバのチタンチューブの部分は水のレベルゲージ（ 図6）を使用して 、レベルになるようにプラットフォームを調整する。
16. チタンチューブアセンブリは移植前に30​​分を回転することができます。

5。ブタ下大静脈へのチタンチューブの注入

1. 手術前に二十四時間、（経皮は100μg/時、場所で× 72時間のパッチを保つ）フェンタニルパッチで（EPCSが分離されたから）豚をpremedicate。
2. 豚NPOを一晩保管し、抗生物質の予防として、術前に手術の日（5 mg / kgを、IM）で、次の7日間24時間ごとにBaytril（エンロフロキサシン）を管理する。
3. 落ち着いた、挿管および1.3で説明したようにブタを麻酔（10 -15ミリリットル/ kgの一回換気量）と手術室のテーブルの上に仰臥位で豚を確保する。酸素飽和度、心拍数と温度を測定することにより、手順の間に豚を監視します。自動化された加熱された手術台と加熱毛布を使用し、注入液を温めることによって体温調節を維持する。
4. 豚の耳静脈に18 G IVのカテーテルを挿入し、Vetropolycinの点眼で豚の目を保護する。
5. クリーン、準備および1.6のように、豚の腹部を羽織る。頭側尾側に設定された最後に第二に乳腺の2セット目から第15手術用メスの刃で正中を切開する。
6. 電気焼灼と腹部筋膜に切開を下に運ぶ。
7. モスキート鉗子で腹膜を持ち上げ、慎重にMetzenbaumハサミでそれを入力してください。
8. 膀胱を外部化し、膀胱の壁に3 - O Vicryl巾着縫合を置きます。その真ん中に刺し切開を置き、16 Fフォーリーカテーテルを挿入する。手術中に> / = 1ミリリットル/ kg / hrのために尿量を滴定する輸液（乳酸リンゲル）管理する。
9. 続いて、小規模および大規模な腸と場所腹膜腔の後面を露出し、下大静脈（IVC）を識別するために2バルフォア外科開創器を外部化。
10. 慎重に、シャープと鈍的切開を使用して周囲の組織からIVCを解放し、遠位IVCの分岐に近右腎動脈から血管を骸骨になる。 IVCでさえ非常に小さな欠陥が動物の急速な出血や失血につながる可能性があるため、IVCの解剖時の細心の注意を払ってください。
11. 移植されるチタン管の周囲の出血がないことを保証するためにIVCのセグメントのすべての側枝を結紮。非常に慎重に解剖し、ライゲーションを必要とする通常大きな2腰椎静脈に注意してください。さらに、大腰静脈が下大静脈の分岐のすぐ近位の一般的な後内側で検出されると無料解剖とクランプの配置の準備として、血管ループで制御する必要がありますのでご注意ください。
12. 同時に4で概説したようにチタンチューブをシードに進みます。
13. IVCをクランプする直前にヘパリンの100 USP / kgを投与する。遠位IVCと腰静脈に45度の角度外科クランプを配置し、近位に。
14. ポッツはさみで拡張子が続く＃11手術用メスの刃を使用して、近位および遠位クランプの間に縦veinotomy（4 cm）を作成します。
15. IVCから血液を退避させ、滅菌DPBSで、その内腔をフラッシュします。
16. 今IVCにEPCシードのチタンチューブを（またはベアメタルコントロール）を挿入し、乾燥から細胞を防止し、空気を排気するようにDPBS（のCaCl _{2、MgCl 2}で）で塗りつぶす。
17. 4から0 Prolene実行中の縫合糸でveinotomyを閉じて、バック出血の少量を通してデ - 空気IVC一つ近位クランプを取り外します。時間をかけてインプラントの移行を防止するためにPVCチューブに静脈壁を通してのご滞在、縫合糸"を置きます。
18. 2 - O Vicryl（縫合を実行している）とCTの針と皮下のスペースにO - PDSと筋膜を閉じます。ステープルで皮膚を閉じます。
19. 皮下切開部位に沿って0.25％Marcaine（ブピバカイン）の20mlにまで管理し、ガーゼとTegadermで傷口をカバーしています。皮下の痛みのために、必要に応じて - またフルニキシン（2.2 mg / kgのQ 24時間）とオキシモルホン（4時間0.15 mg / kgのQ 3）を得た。
20. 麻酔を中止し、覚醒まで豚を監視し、ケージに戻ります。苦痛/痛み、地位、歩行、糞便および尿の出力、および正常な血流を示す皮膚の色の兆候を毎日二度豚を監視します。

6。チタン管の植

1. 1.3で説明したように3週間後に、落ち着いた、豚を挿管し、麻酔- 1.4。
2. 5.8 -として5.5で説明開腹に進んでください。
3. 瘢痕化すると、インプラントのサイトを隠すでしょうが、 その場で剛性チタンチューブを触診できることに注意してください。
4. として5.9に説明したIVCばらばらにする- 5.11と重いハサミで周囲のIVCとチタンチューブエンブロックを外植片。
5. Euthasol安楽死溶液（390 mg / mlのペントバルビタールナトリウムとを1ml / 10ポンドで50 mg / mlのフェニトインナトリウム）で動物を安楽死させる。

7。固定とイメージングのTi内面

1. DPBS溶液中のチタン管を摘出した静脈のセグメントをすすぎ、高解像度デジタルカメラ（ 図7）でその内腔（特許または閉塞）を撮影する。
2. 続いて、15​​分の最小値は3.7％パラホルムアルデヒドで水没によって試料を修正。 DPBS溶液中で試料を洗浄します。
3. 非常に慎重に周囲の静脈やチタンチューブを開くためにPVCチューブを切開する。赤/オレンジ色（ 図8A）にPKH26標識EPCを可視化するために550nmの励起波長の下で客観的/光源と画像が直面している内側の表面と蛍光顕微鏡下で3つのセクションに置きます。必要に応じて、細胞（例えば、血小板内皮細胞接着のマーカー（PECAMセルの罫線（ 図8B）、核を可視化するためにDAPI -染色、などを可視化する） -染色）さらに染色可能です。

8。代表的な結果：

このプロトコルの実行の後、医師や科学者が大規模な動物モデルにおける自己血由来の内皮前駆細胞と固体チューブ構造をendothelializeすることができる。 図は、私たちの方法で分離されたEPCはは約7日後には石畳の形態を持つコロニーとして表示される2に示すように文化。 図5と図6に示す私たちのシードデバイスは、無菌条件下^9条管の内面の均一なカバレッジのEPCサスペンションと結果で満たされたチタンチューブの遅い回転することができます。

私たちの移植手術は大動物モデルにおける血栓症のために、例えばTiのような生体材料の傾向を、テストすることができます。我々は、豚はよく、この手順を容認することと、この移植が唯一の最小限の失血とし、EPCの層を中断させることなく達成できることを見出した。

私たちのEPCライニング管であっても下大静脈の血栓症、低せん断環境で特許残るのに対し、裸の ​​チタン管が完全に、閉塞いるT"> 図7に示す。さらに、蛍光標識細胞のコンフルエントな層の存在が確認さ図8に示すように、この方法の成功。

図1。自家血管内皮前駆細胞（EPC）播種実験の模式図。最初に、末梢血はブタから描かれています。次に、EPCは血液から分離し、培養で増殖されています。 EPCはその後、その後、外科的に細胞が単離されたから、同じ豚の下大静脈に注入されるチタン（Ti）チューブのデバイスを、整列するために使用されます。

図2。文化のEPCは、単離操作後約7日間（イメージングカメラとQCaptureソフトウェアと反転ライカDMIL顕微鏡で撮像）の代表コロニー。

組立て前に図3。チタンチューブセクション。チタンチューブは、長手方向に3等分に切断し、4.5センチメートルの長さに切断される。 Tiのセクションの内側の表面は目に見えるピットを削除するには、卓上グラインダーとエメリー布を使用して研磨されています。

図4。PVC熱収縮チューブ（青）とヒートガンを持つチタン管セクションの組み立て。 Tiのセクションは、Tiのセクションを通って延びるとTiのチューブ内径の寸法に一致するアルミ削り出しのマンドレル上でサポートされています。

図5チタン管アセンブリ、すべてのコンポーネントを表示：PVCラップ（青）とルアーキャップ、注射器"ヘッドピース、"シリコンチューブ、およびチタンチューブ。アセンブリは、外科的使用のために滅菌前に一緒に置かれている。

モーター、プラットフォームを示すインキュベーター内部に図6。チタンチューブシードセットアップは、アルミのシリンジホルダー、チタン管アセンブリ、および5 ccシリンジを機械加工。注：アセンブリは、可視化の目的のために保護滅菌シースなしで表示されます。

図7。移植手術の代表的な粗結果。ブタ下大静脈（IVC）において、移植後の制御ベアメタルのTi管の（A）エンドビュー。内腔が完全に固体の塊で閉塞しているチューブ。注入後のEPCシードのチタンチューブの（B）エンドビュー。チューブ内腔は完全に特許とは明らかである。対照の（C）ディテールに秘められたビュー（裸）チタンチューブ3日間注入した後、血栓症の程度を（実験は同一の結果と3週間の期間までに実施された）を示す。

図8。3日間の移植後のチタンチューブの表面上のEPC（デジタルカメラやイメージプロプラスソフトウェアをモノクロQImaging QICAMで直立ライカDMRB顕微鏡で撮像）。 （A）PKH26手術前のラベルを示す表面上にコンフルエントな細胞。 EPCの（B）コンフルエントな層。赤：PKH26手術前のラベリング。グリーン：EPC PECAM -染色。

ディスカッション

ここで提示細胞播種チタンチューブの方法は、迅速かつ均一endothelializeに医師や科学者を可能に血液を接触させ、移植可能なデバイスの表面を。我々は末梢血サンプルからEPCを分離し、拡大しているので、大きな侵襲的処置は、これらの細胞を回収する必要はありません。また、EPCは自己であるため、セルシードのインプラントへの免疫反応の危険性が除去されます。彼のプロトコルで示さ原則は、チタン管のためだけでなく、心血管医学に利用されている他の多くの生体材料、のために利用することができます。

我々は汚染物質妥協の細胞接着のそのあらゆる接着フィルムを見つけたとして、このプロトコルの重要なステップは、チタン管の念入りな清掃です。さらに、遅い回転速度が（チューブの直径に反比例）播種の過程で不可欠である、そのようなことEPCは徐々に落ち着くとTiのチューブが移動しているように表面に付着することがあります。

注入直前に播種の我々の手法は非現実的なex vivoで培養時間を避けることができます。細胞が個々に付着し、後ですぐに流れの再構築は、次のシートとして塞栓の可能性を回避すること、 生体内でコンフルエントシートを形成する。私たちの先行研究では、EPCはコンフルエント層に成長した後、彼らはさらに内皮シートのすべての可能な脱落を最小限に抑え、彼らはしっかりと付着する細胞外マトリックスを作ることを示している。塞栓剥離の可能性を完全に排除できないものの、それは、デバイス全体の表面の血栓症より多種多様のリスクが低く、この治療法は防ぐように設計されている問題のようです。

低せん断への移植の我々のアプローチは、下大静脈の血栓環境では、血液適合性および装置^5,6の血栓症を研究するための最も信頼される大規模な動物モデルのいずれかを利用しています。すべての動物の世話と実験は実験動物の管理と利用のための健康ガイドラインの国立研究所ととのみデューク大学動物実験用の委員会の承認後にしたがって実施されたことに注意してください。

成功した生体材料およびデバイスをテストするには、この注入法を利用するために、それは辛抱強くIVCのセグメントを骸骨になると、デバイスの周囲の出血が"偽腔"に由来していないようにデバイスを挿入するための準備として、すべての静脈の分岐血管を、連結することが重要です。別の重要なステップは、内側のチューブの表面上に細胞がveinotomyの閉鎖中に湿ったままで、再灌流が開始される前にいるようなデバイスの内腔へのDPBSの追加です。デバイスは、それが移植された場所に見つからない場合は、それはIVCの"上流"に移行している可能性があります。 PVCチューブの3 mmのセクションをチューブがしっかりとその現在の場所に固定されるように - これは、静脈の壁を通って、2を介して縫合糸（4 - O Prolene）を配置することによって防ぐことができます。研究者はそうでなければ特許チューブに植後の図8に示すように蛍光あらかじめ標識された細胞を見つけることが困難なはずですが、これは細胞が首尾一貫したシートとして剥離れている可能性があります。これは、チューブと一緒に静脈を固定した後、3 Tiのチューブセクションの周囲の静脈や放電アセンブリの非常に穏やかな解離することによって防ぐことができます。

当社の技術はEPC -播種によって心血管装置の血栓症を防止するための証明の概念を提供します。この技術は、患者自身の血管内皮前駆細胞が並ぶ"生体"インプラントの開発に使用することができます。私たちのブタ動物モデルでの実現可能性調査は、臨床の現場にこの"オーダーメイド医療"の翻訳に向けた最初のステップのために用意されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬	企業名	カタログ番号	コメント
アセプロマジン	ベーリンガーインゲルハイム	BIC670025	NAC＃10280002
Alconoxパワード精密クリーナー	Alconox	1104
バルフォア外科トラクター	アドラー	N /
Baytril	バイエル	APVMA 46028/0705
翼状針（19G）	テルモ	SV19CLK
クロルヘキシジン	3M	9200
クランプ（45度）	Aesculap	FC339T
DPBS (-/-)	ギブコ	14190-144
DPBS (+/+)	ギブコ	14040-133
DuraPrep	3M	8635
EBM - 2培地	ロンザ	CC - 3156	両方の血清自由かつ完全な増殖培地のベース
EGM - 2 SingleQuots	ロンザ	CC - 3162	両方の血清自由かつ完全な増殖培地用EBM - 2と組み合わせて使用
電気焼灼ツール	Valleylab	SurgII - 20
エメリー布	3M	60-0700-0425-8	240グリット
Euthasolの安楽死のソリューション	Virbackアニマルヘルス		穴田＃：200〜071
フェンタニルパッチ	Actavis		NDC＃67767-120-18
フルニキシン	シェリングプラウ		NAC＃：10470183
フォーリーカテーテル（16F）	吟遊詩人	730116
HBSS	シグマ	H8264 - 500ML
ヒートガン	ミルウォーキー	8988〜20
ヘパリン			NDC＃：25021
Histopaque - 1077	シグマ	H8889 - 500ML
挿管チューブ	Mallinckrodt	86113
イソフルレン	MWI、メリディアン		NDC＃13985-030
静脈カテーテル（18G）	ベクトンディッキンソン-	381547
ケタミン	フォートドッジ		NDC＃0856-2013
レベル	スワンソン	LLA001
ルアーロック先端キャップ	CMLサプライ	909から001
Marcaine	ホスピーラ		NDC＃：0409-1560-10
Metzenbaumはさみ	アドラー	N /
マイクロイントロ（5F）	ゴールト	KIT 002から01
モスキート止血鉗子	アドラー	N /
モーター	HerbachとRademan	H1 - 08
オキシモルホン	遠藤研究所		NDC：63481-624-10
PKH26色素キット	シグマ	PKH26GL - 1KT
ブタ血清	ジェミニバイオ製品	100から115	完全増殖培地で2％濃度
ポッツはさみ	アドラー	N /
正確なビスタスキンステープラー	3M	3998
PVCチューブ	McMaster-Carr/Insultab	7132K117	拡大ID 15.88ミリメートル、 回収されたID 7.95ミリメートル
アングルミディアムサイズ	アドラー	N /
手術用メスの刃（＃10-15）	吟遊詩人	373910
シリコンチューブ	マクマスター - カー	51735K26	16.64ミリメートルOD、9.52ミリメートルのID
シリンジ（5ccの）	ベクトン-ディッキンソン（BD）	309603
Tegaderm	3M	90001
三方活栓	ケンドール	170060
チタンチューブ	ティコチタン	N /	½"OD、0.065"壁、0.370"ID、0.1737ポンド/フィートのように指定
トリプシン	ロンザ	CC - 5012
トリプシン中和溶液（TNS）	ロンザ	CC - 5002	0.03パーセント
Vetropolycin	Pharmadermアニマルヘルス		NAC＃：12920110
Vicryl縫合糸（3-0）	エチコン	J808T
水浴ソニケーター	ブランソン	B200