ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

サマリー

伝統的な、二次元細胞培養技術は、しばしば、分化マーカー、サイトカインおよび増殖因子に関する変更特性になる。 extravillous栄養膜細胞株を以下に示すように回転する細胞培養系における三次元細胞培養（RCCS）は、これらの要因の多くの表現を再確立します。

要約

人間の栄養膜研究の分野では、胎盤形成の間に確立された複雑な環境を理解する上で役立ちます。これらの研究の性質上、in vivoの実験で 、人間は不可能です。初代培養、外植培養と栄養膜細胞株¹の組み合わせは、子宮壁²の侵略と妊娠の成功確立のために必要とされるextravillous栄養膜細胞（EVTs）による子宮螺旋動脈^3,4の改造の我々の理解をサポートしています。このようなモデルから収集した豊富な知識にもかかわらず、それは彼らのin vivoでの対応で ^5,6と比較した場合、EVTのような細胞株を用いた in vitro細胞培養モデルにおいて細胞のプロパティを変更し表示することが受け入れられている。回転細胞培養システム（RCCS）で培養した細胞は、より密接にUで差別化を模倣することEVTのような細胞株の、形態学的表現型、および機能的特性を表示する侵略（例：マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP））と栄養膜の分化^7,8,9を仲介する遺伝子の発現増加とテロササナEVTs、。サンジョルジュ病院胎盤細胞ライン- 4（SGHPL - 4）（親切に先生ガイウィットリーと博士ジュディスカートライトによる寄贈）RCCSでテストするために使用されたEVT様細胞株です。

RCCSの培養容器のデザインは、臓器および組織の3次元（3 - D）の環境で機能するという原則に基づいている。生理学的に適切なせん断の条件を含む容器内の動的な培養条件、のために、三次元的に培養した細胞は、天然の細胞の親和性に基づいて、凝集体を形成し、アセンブリ^10,11,12器官のような組織に分化する。流体の軌道の維持は、 生体内に存在する条件と同様の低せん断、低乱流の環境を提供します。培養細胞の沈降は、回転を調整することによって打ち消された細胞の一定の自由落下を確実にするためにRCCSの速度。ガス交換は、バイオリアクターの背面に透過性の疎水性膜を介して行われます。それらが多孔質マイクロキャリアビーズの表面上で培養されているため、 生体内での彼らの親の組織と同様に、RCCSに成長した細胞は三次元（それらの、頂端基底、および側面即ち）で化学と分子勾配に対応することができます。プラスチックのような不浸透性の表面上の2次元単層として増殖させた場合、細胞はその基底面では、この重要なコミュニケーションを奪われている。そのため、環境によって課された空間の制約が深くこうして3次元環境¹³の重要な役割を示唆し、周囲の微小環境からどのように細胞の感覚とデコード信号に影響を与えます。

我々は^{、7,14,15,16、}様々な人間の上皮組織の生物学的に意味のある3 - Dモデルを設計するRCCSを使用している。実際、多くの過去の報告では、DEMデータを持っているRCCSで培養された細胞は、他のモデル^10,17-21では実現されていない生理学的に関連する表現型を担うことができることonstrated。要約すると、RCCSの文化は、実験操作の様々な従順な分化した細胞を大量に提供する簡単に、再現性、高スループットのプラットフォームを表します。次のプロトコルでは、例としてEVTsを使用して、我々ははっきりとRCCSに3次元的に培養接着細胞に必要な手順を説明します。

プロトコル

1。コラーゲンビーズの調製

1. 前の3次元細胞培養のためのロードEVTsに、一つはCytodex 3マイクロキャリアビーズを準備する必要があります。
   1. 実験に必要なCytodex - 3ビーズの適切な量を秤量。このプロトコルは、ビーズの0.05グラムが必要とされる、10ミリリットルRCCSの容器に適合されている。 50ミリリットルRCCSの容器の場合、スケールは調整する。 50mLのオートクレーブ可能な円錐管で、12mLダルベッコのリン酸との混合250mgのCytodex - 3ビーズが溶液（DPBS）をバッファ。この金額は、5 RCCS船で十分です。
2. オートクレーブ処理が蒸発につながるように十分なボリュームが、円錐管に存在していることを確認します。大まかに110℃で10分間チューブ、オートクレーブを締めくくる℃に
3. オートクレーブサイクルの完了時にコニカルチューブを外し、Cytodex - 3ビーズ溶液を冷却することができます。
4. コニカルチューブは室温に冷却した後、1X DPを使用して12.5mLに総量をもたらすために無菌テクニックを使用してBS。
5. キャップと室温で作製Cytodex - 3ビーズを格納する。準備ビーズが膨潤し、使用前に室温に冷却してください。 Cytodex - 3ビーズの上記製剤は、5つの10mLのRCCSの船のために提供します。我々は、コラーゲンが約1ヶ月後に不安定になるように室温でCyto....

ディスカッション

ここで紹介する培養技術は、高度に侵襲EVT様細胞との調査官が用意されています。それは今分化の損失が三次元（心尖部、基底、および横方向のセルの表面^）10,13における化学と分子の手がかりに対する細胞応答の阻害に起因する単層で発生することが認識されている。この手法は、EVTの細胞を侵入に子宮内に記載されている特性を反映している。手順は、従来の単層組織培養時間の動態を模倣するが、差動式で細胞を提供するので、比較アッセイを用いることができる。細胞塊はいつでも実験で使うために収穫されることがあります。クラスタやコラーゲン分解が単一の細胞懸濁液として細胞を単離するために用いることができるとして、それらを使用することができます。 Cytodex 3マイクロキャリアビーズは、個々の研究室"特定の利害をより助長するかもしれない他の細胞外マトリックス（ECMに）でコーティングされた足場やマイクロキャリアビーズに​​置換してもよい。 Alternatively、細胞培養用インサートとスピナーフラスコ^10,23のような特定の細胞型の培養条件、より助長するかもしれない他の多.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
Cytodexマイクロキャリアビーズ	シグマアルドリッチ	C3275
回転細胞培養システム（RCCS）	Synthecon	RCCS - D	ローターベース、電源、4使い捨てRCCSユニットが含まれています
RCCS使い捨てユニット	Synthecon	お問い合わせSynthecon
3ミリリットルルアーロックチップシリンジ	BD	309585
10ミリリットルワイド先端血清用ピペット	BD	357504
MEMアルファ	インビトロジェン	12561-072
リーボビッツのL - 15培地、粉	インビトロジェン	41300-039
H 2 O、エンドトキシンフリー	フィッシャー	MT - 25 - 055 - CM
重炭酸ナトリウム	シグマアルドリッチ	S - 7795
ペプトン	フィッシャーサイエンティフィック	BP1420 - 100
果糖	シグマアルドリッチ	F3510 - 100
ガラクトース	シグマアルドリッチ	G5388 - 100
グルコース	シグマアルドリッチ	G7528 - 250
HEPES	インビトロジェン	15630-080
L -グルタミン	インビトロジェン	25030
インスリン - トランスフェリン - 亜セレン酸ナトリウム（ITS）	シグマアルドリッチ	I1884
FBS	インビトロジェン	10437
ペニシリン - ストレプトマイシン	インビトロジェン	15140