酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

サマリー

酢酸キナーゼ活性の測定方法について説明する。このアッセイは異なるホスホリルアクセプターで、酢酸を形成する方向に酢酸キナーゼの酵素活性と反応速度を決定するための直接的な反応を利用している。さらに、この方法は、酵素を利用する他のアセチルリン酸塩またはアセチル- CoAを検定するために利用することができます。

要約

酢酸キナーゼ、酢酸、砂糖キナーゼ- Hsp70の-アクチン（ASKHA）酵素のスーパーファミリー^1-5のメンバーは、基質としてATPを利用したアセチルリン酸への酢酸の可逆的リン酸化を担当しています。酢酸キナーゼは、 古細菌の一属で見つかった、 細菌のユビキタスであり、またEukarya ⁶の微生物中に存在する。最もよく特徴付け酢酸キナーゼは、メタンガスを作り出す細菌Methanosarcinaサーモ ^7月14日からということです。唯一のリン酸塩形成アセチル方向にATPない_私を PPに利用できますが、酢酸キナーゼは、 赤痢アメーバ 、アメーバ赤痢の病原体から分離されており、これまでこの属^15,16でのみ発見されました。

アセチルリン酸形成の方向では、酢酸キナーゼ活性は、通常、最初リップマンによって記述された、ヒドロキアッセイを用いて測定され^17-20、ADPへのATPの変換が酵素のピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素^21,22、またはアセチルリン酸塩の製品との反応後の無機リン酸の放出を測定するアッセイによりNAD ⁺にNADHの酸化に結合される結合アッセイヒドロキシルアミン²³と。反対の活動は、酢酸を形成する方向は、ADPからNADPの還元⁺酵素のヘキソキナーゼとグルコース-6 -リン酸脱水素酵素²⁴によりNADPHにするためにATPの形成を結合することによって測定されます。

ここでは、カップリング酵素を必要としない酢酸の形成の方向に酢酸キナーゼ活性を検出するための方法を説明しますが、代わりにアセチルリン酸の消費量の直接測定に基づいています。酵素反応の後、残りのアセチルリン酸塩は、ヒドロキアッセイ用として、分光光度法で測定することができる第二鉄ヒドロキ複合体に変換されます。このように、STとは異なり、ADPからATPの生産に依存しているこの方向のandard結合アッセイは、この直接的なアッセイは、ATPまたはPP _iを生成する酢酸キナーゼのために使用することができます。

プロトコル

このプロトコルの全体的なスキームを図1に概説されている。

1。標準曲線とアッセイのためのソリューションの準備

1. ヒドロキシルアミン塩酸の2モル/ Lの溶液100 mLを準備します。ヒドロキシルアミン塩酸塩の13.9グラム（MW 69.49グラム/モル）を秤量し、約50 mLの蒸留-脱イオン水（のddH ₂ O）に溶解する。水酸化カリウムペレットまたは濃縮液を用いてpHを7.0に調整する。 100mLのへの最終的なボリュームをもたらす。ソリューションは、最大30日間や4℃で90日まで室温で保存することができます。
2. 塩化第二鉄/塩酸溶液100mLを準備する。 13.5グラム塩化第二鉄（MW 270.32グラム/モル）を秤量し、約50 mLののddH _{2 O}に溶解41.3 mLの濃塩酸（12.1モル/ L）を追加し、100mLの最終容量にもたらす。塩化第二鉄の最終濃度は0.5モル/ Lと塩酸の終濃度が5モルとなるようになります/ L.溶液を室温で保存されます。
3. trichoroacetic酸1.84モル/ Lの溶液100 mLを準備します。トリクロロ酢酸（MW 163.39グラム/モル）の30.0 gを秤量、のddH ₂ Oに溶解し、100mLの最終容量をもたらす。溶液を室温で保存されます。
4. 0.1モル/ Lアセチルリン酸溶液5 mLを準備します。 0.092グラムアセチルリン酸（MW 184.06グラム/モル）を秤量、のddH ₂ Oに溶解し、5 mLの最終的なボリュームをもたらす。注しマイクロ遠心チューブ（管当たり0.25 ml）に解決策と、使用時まで-20℃で凍結。解凍した溶液を氷に配置する必要がありますし、約1時間使用することができます。融解されたアセチルリン酸溶液は、再凍結になると、再使用しないでください。
5. ADPの0.1mol / Lの溶液5mlを準備します。 ADP物0.24g（MW 472.5グラム/モル）を秤量、のddH ₂ Oに溶解し、5 mLの最終的なボリュームをもたらす。 -20分注しマイクロ遠心チューブ内の溶液（試験管当たり0.5mL）を、凍結° Cまでの使用してください。使用するまで氷上で解凍したソリューションを保管してください。
6. トリスの1モル/ Lの溶液50mlを準備します。 6.06グラムトリス（MW 121.14グラム/モル）を秤量し、40mLののddH _{2 O}に溶解塩酸を用いて7.0に溶液のpHを調整し、50 mLの最終的なボリュームをもたらす。室温で保管ソリューション。
7. 1モル/ L塩化マグネシウム溶液10 mLを準備します。 2.03グラムの塩化マグネシウム（MW 203.31グラム/モル）を秤量、のddH ₂ Oに溶解し、10 mLまで最終的なボリュームをもたらす。室温でソリューションを保存してください。
8. 塩化第二鉄/塩酸溶液及びトリクロロ酢酸溶液の等量を混合して25 mLの開発ソリューションを準備。開発ソリューションは、毎日新しく調製し、室温で保存してください。

2。アセチルリン酸の標準曲線の作成

1. アセチルリン酸の標準曲線は、アセチルリン酸の既知量を使用して生成されます。 eighに6つの標準曲線tの点が適しています。規格は、0.1〜3ミリモル/ Lの最終濃度に相関する、0.03μモル〜300μLあたり0.9μモルまでの範囲とする300μLの最終容量で100mMトリス溶液中での適切な濃度にアセチルリン酸ストック溶液を希釈する。アセチルリン酸を含まない対照サンプルも準備する必要があります。
2. ℃のヒートブロックで1分間37℃でそれぞれ標準とコントロールをインキュベートする。
3. 各規格へのヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を3回振って、コントロールとミックス50μLを加える。 60℃のヒートブロックに標準を置き、5分間インキュベートする。
4. 、規格及び制御するための開発溶液100μLを追加して三回振って混合し、色は、室温で少なくとも1分間のために開発することができます。
5. 1分間18,000 × gで遠心機ですべての基準やコントロールを遠心分離します。
6. 分光光度計でサンプルを測定分光光度計用のブランクのようなコントロールを使用して、1mLのプラスチックキュベットを用いたT 540nmの。
7. 適切なデータ分析とグラフ作成ソフト（例：カレイダ、シナジーソフトウェア）を使用して標準曲線を生成します。 0.99以上のR ²値が望ましいです。データは、アセチルリン酸の存在のμモルに対し、540nmの吸光度としてプロットされます。

3。酢酸キナーゼ活性のアッセイ

1. 説明するソリューションを使用して、0.1mol / Lのトリス緩衝液、10ミリモル/ L塩化マグネシウム、5ミリモル/ L ADP、および2ミリモル/ Lアセチルリン酸の最終濃度を含む反応ミックスを準備する。 10mLの反応混合物は8.2 mLののddH ₂ O、1.0 mLのトリス溶液、0.1 mLの塩化マグネシウム溶液、0.5mLのADPのソリューション、および0.2 mLのアセチルリン酸溶液が必要になります。マイクロ遠心チューブに300μlのアリコートで反応ミックスを配布する。動力学的パラメーターと基質濃度の最適化の判定のために、一方の基板にすることができます変化や反応に一定の濃度で開催された他の。
2. 37℃で1分間反応をプレインキュベート℃のヒートブロックインチ
3. 反応する酵素の所望の量を加え、直ちに37℃のヒートブロックにチューブを返します。また、酵素なしが追加されていないため、コントロールの反応が含まれています。いくつかの反応が行われている場合、特定の時間間隔でチューブに酵素を加える。時間を追跡するようにしてください。 （注：使用する酵素の量は、アセチルリン酸またはADPの基板のすべてが枯渇されないことを保証するために最適化する必要があります - ディスカッションのセクションを参照してください）
4. 5分後、各反応と制御、ミックスにヒドロキシルアミン塩酸塩溶液の50μlずつを追加し、60℃のヒートブロックにチューブを置きます。いくつかの反応が実行されている場合、酵素が追加されたとして、これは同じ時間間隔で行われる必要があります。
5. 60℃5分間反応とコントロールをインキュベート℃に
6. 100＆を追加します。ムー、各反応の開発ソリューションと制御、混合、およびラボのベンチ上にチューブのラック内の場所のL。色は、少なくとも1分間開発することができます。
7. 1分間18,000 × gで遠心ですべてのチューブを遠心してください。
8. 1mLのプラスチックキュベットを用いて540nmで分光光度計でサンプルを測定し、アセチルリン酸標準曲線と比較してアセチルリン酸の存在量を決定する。
9. 枯渇アセチルリン酸基質の量は、コントロールが欠け酵素に存在するアセチルリン酸の量から酵素反応後に残存するアセチルリン酸の量を差し引くことによって決定することができます。適切なデータとグラフ作成ソフト（例：カレイダ、シナジーソフトウェア）を使用してデータ分析を実行します。 0.97よりも大きいのR ²値が望ましいです。

4。代表的な結果：

この検定の目的は、直接的に酢酸キナーゼの活性を測定することです。酢酸の形成のイオン。酢酸の生産のための簡単​​な、直接的な測定法がないため、これは、アセチルリン酸基質の消費量を測定することによって行われます。酵素反応の間に所定の時間後に残っているアセチルリン酸はアセチルヒドロキへと続いて540nmで測定可能な赤みを帯びた色（図2）を持つ第二鉄ヒドロキコンプレックス、に変換されます。標準のμモルアセチルリン酸塩の存在対吸光度をプロットする標準曲線は、それぞれの反応に残っているアセチルリン酸の量を決定するために使用されます。標準曲線は、ゼロ点を通る直線になります。図3に示されている代表的な標準曲線は、データだけでなく、線形方程式をフィットを示し、モルアセチルリン酸の存在と0.99のR ²値あたり1.2332吸光度単位の傾きを持っています。検量線のデータに線形近似の式は、反応に残っているアセチルリン酸の量を計算するために使用されます。 μモル消費アセチルリン酸の酵素と酵素反応後に残存アセチルリン酸塩のμモルを欠く対照反応中に存在するアセチルリン酸塩のμモルの間の差として決定されます。

精製、組換えM.テルモの酢酸キナーゼは、記述されたプロトコルを用いて測定した。図4に示す実験では、ADPの濃度が5ミリモル/ Lで一定に保持し、反応のアセチルリン酸塩の濃度は、アセチルリン酸に対するK m _を決定するために変化させた。予想通り、この実験では酵素は、それぞれの基質に対する標準的なミカエリス - メンテンのような動態を、次のとアセチルリン酸塩の濃度に対して活性をプロットするときに双曲線の飽和曲線を生成したことを示している。アセチルリン酸の見かけのK _m値は0.27 ± 0.47の公開K _m値に遜色0.01ミリモル/ L、±結合などを使用して0.01ミリモル/ Lであった¹³と言う。

直接アッセイはまた、標準的な結合アッセイを使用して不可能であるATP、以外の基質を利用する酢酸キナーゼの活性を測定するために使用することができます。組換え大腸菌を精製酢酸を形成する方向に_I PPではなく、ATPを生成する赤痢アセテートキナーゼ^16は 、ADPの代わりにリン酸ナトリウムを使用して、このアッセイに供した。反応でリン酸ナトリウムの濃度は0.2モル/ Lで一定に保持され、アセチルリン酸塩濃度を変化させた。 M.用としてテルモの酢酸キナーゼ、E.赤痢の酢酸キナーゼは、アセチルリン酸と双曲線の飽和曲線のミカエリス-メンテンのような動力学を追った（図5）が観察された。アセチルリン酸の見かけのK _m値は0.50 ± 0.006ミリモル/ Lであった。リーブスとガスリー^15はネイティブ酵素のアセチルリン酸0.06ミリモル/ LのK _m値を決定し、どのようにこれまで、それらの酵素は、部分的にしか精製され、それらのアッセイはまた、部分的にしか精製された4つのカップリング酵素を関与していた。したがって、これらの値を直接比較することは困難です。

プロトコルスキーム

1. アセチルリン酸の標準曲線を生成する
2. 所望の濃度に酵素を希釈する
3. マイクロ遠心チューブに反応混合物、アリコートを300μlを準備
4. 1分間で37 Preinc​​ubate反応が° C
5. 特定の時間間隔で酵素を加えることによって反応を開始します。
6. 反応を停止し、60℃でインキュベートすることと同じ間隔でヒドロキシルアミンを追加℃で5分間
7. 塩化第二鉄/カラーの開発のためのトリクロロ酢酸溶液を加える
8. 1分間18,000 × gでチューブを遠心
9. 540nmで吸光度を測定
10. 標準曲線との比較で消費されるアセチルリン酸の量を決定する

tp_upload/3474/3474fig1.jpg"/>
図1プロトコルスキーム

図2。アセチルリン酸塩の規格 。アセチルリン酸塩濃度の増加は、ヒドロキシルアミンと色と反応させた説明したように開発されました。アセチルリン酸を欠くコントロールは明るい黄色で、アセチルリン酸の増加量を含有する反応物は色が連続的に暗いです。この色の変化は、540nmで測定されます。

図3サンプルアセチルリン酸の標準曲線。アセチルリン酸の様々な量は、ヒドロキシルアミンと反応させると発色液と吸光度を540nmで測定した。 μモルアセチルリン酸に対する540nmでの吸光度をプロットし、データへの線形近似を適用した。

図4。ATP産M.のアセチルリン酸の活用テルモの酢酸キナーゼ 。酵素活性は、アセチルリン酸の様々な濃度の5ミリモル/ L ADP存在下での酢酸の形成の方向で決定されたものです。アセチルリン酸の消費量は、反応や酵素反応後に残存アセチルリン酸の量のアセチルリン酸の開始量との差として決定された。アッセイは、示されたエラーバー付きの三連で行った。

図5。PP _I産E.によるアセチルリン酸の活用赤痢の酢酸キナーゼ 。酢酸の形成の方向で酵素活性が0の存在下で決定された。アセチルリン酸の濃度を変えると、2モル/ Lリン酸ナトリウム。アセチルリン酸の消費量は、反応や酵素反応後に残存アセチルリン酸の量のアセチルリン酸の開始量との差として決定された。アッセイは、示されたエラーバー付きの三連で行った。

ディスカッション

このアッセイにおけるアセチルリン酸の検出は、ヒドロキシルアミン塩酸塩と塩化第二鉄溶液の濃度と酸性度の十分な濃度に依存している。アッセイ体積の変化は、これらのコンポーネントの両方の見直しが必要になります。酵素反応は、ここで説明し、37℃60℃実行ヒドロキシル終端を持つC℃で5分間で行った。これより高い温度は、アセチルヒドロキに残っているアセチルリン酸塩の迅速な変換を可能にするために重要です。吸光度の発色のステップと測定のタイミングはそれほど重要ではありません、とヒドロキシルアミン溶液の添加後わずか5分、最大15分で行うことができます。サンプルの酸性度は、酵素の沈殿につながる可能性がありますし、濁度ではなく、実際の色の変化が原因で誤って高い値を生成できるようにサンプルは、吸光度を読み取る前に遠心分離されるべきである。開発した反応の内訳は、10〜15分後に発生を開始します。

酵素反応速度を調べるためのこのアッセイの主要な合併症は、使用する酵素量と反応の最初のステップを実行する時間の長さの測定です。これらは、活動のレベルは、アセチルリン酸の基材のすべてが消費されるようではないというようなそ...

材料

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
アセチルリン酸	シグマアルドリッチ	01409	リチウム塩（97％）
ナトリウム一塩基性リン酸（脱水）	ThermoFisher	S381
ナトリウム二塩基性リン酸（無水）	ThermoFisher	S374
塩化マグネシウム（六水和物）	ThermoFisher	M33
トリスベース	ThermoFisher	B152
塩化第二鉄（六水和物）	ThermoFisher	I88
トリクロロ酢酸	ThermoFisher	A324
ヒドロキシルアミン塩酸塩	ThermoFisher	H330
5' -二リン酸アデノシン ナトリウム塩	シグマアルドリッチ	A2754
Biomate III分光光度計	ThermoFisher	142982082	標準的なUV /可視分光光度計