モデリングとイメージング、3次元の集団細胞浸潤

サマリー

三次元細胞外マトリックスへの腫瘍細胞の浸潤のモデルより反映 in vivoで状況。蛍光標識細胞の共焦点イメージングと組み合わせたマトリックス浸潤アッセイを使用して、侵略モードと主要な対後の細胞の明確な寄与に関する詳細な情報を得ることができる。

要約

癌の悪性腫瘍の特徴は、浸潤転移¹です。いくつかの癌（E. グラム 。神経膠腫^2）で、健康な組織を周囲に局所浸潤は、病気や死亡の根本的な原因です。他のがんの場合（E. グラム 。乳房、肺、 等 。）、それは腫瘍細胞は、原発腫瘍塊から移動遠位部位を植民地化し、最終的に臓器不全に関与する、転移のプロセスであり、それは最終的に罹患率につながると死亡^3。それは、浸潤転移は、がんによる死亡⁴の90％に責任があると推定されている。その結果、改善の診断と治療⁵の目的のために浸潤転移の分子プロセスと重要なタンパク質のメディエーターを特定するのに強い関心が集まっている。

癌の科学者にとっての課題は、十分にin vivoの状況に似ている浸潤アッセイを開発することである正確な病気のモデリング^6を有効にする。二次元の細胞の運動性アッセイは、侵略の一つの側面についてのみ有益であり、また重要な要素になっているアカウント細胞外マトリックス（ECM）タンパク質のリモデリングは考慮されていません。最近、研究では、腫瘍細胞の浸潤の我々の理解を精緻化し、個々の細胞は細長いまたは丸みのモード⁷で動く可能性があることを明らかにした。さらに、癌⁸の普及に、特に上皮特性を維持する高度に差別化された腫瘍の細胞はストランド、シートやサーバークラスタ内に侵入した集団的侵略の貢献のより深い理解を、、、があった。

私たちは、集団的侵略¹⁰に候補タンパク質の寄与を調べるための洗練された方法^9を提示する。特に、異なる蛍光タンパク質を発現する細胞の工学的に個別のプールで、それは分子的に活動してproteiを分析することが可能です。NSは、以下の細胞で必要とされる対リードする細胞に必要。 RNAiの使用は、実験的に個々の細胞侵入だけでなく、集団の侵略の異なる位置に関連するプロセスを分解するための分子ツールを提供しています。この手順では、蛍光標識した細胞の混合物が以前にマトリゲルECM蛋白質で満たされたトランスウェルインサートの底に播種され、その後、フィルターを通過し、マトリゲルに"上向き"に侵入することができました。 3次元表現への共焦点イメージングで得られたZシリーズの画像スタック、、の再建は、総称してストランドとリードに対する次のような位置で蛍光標識した細胞の表現の分析を侵入の可視化が可能になります。

プロトコル

1。蛍光タンパク質と細胞のレトロウイルスラベリング

1. 0.25 × 10 ⁶細胞におけるウェルあたり6ウェルの外プレートレトロウイルスパッケージング細胞（ 例えばフェニックス） 10％ウシ胎児血清（FBS）/ DMEMで料理。
2. レトロウイルスDNAとトランスフェクション細胞を48時間後に細胞はメーカーの指示に従ってEffecteneを使用。
3. 後で培地で2回24時間の井戸を洗い流した後、ウェルあたり10％FBS / DMEM 1.5 mlを加える。
4. 2 mlのマイクロチューブにピペッティングし、転送することにより、48時間後に組織培養の培地にパッケージ化ウイルスを収集する。
5. ペレット任意のセ​​ルに5分間1600 rpmで遠心する。
6. -80きれいなチューブに上清と格納、削除℃の
7. レトロウイルス形質導入される細胞を6ウェルディッシュのウェル当たり1.5 × 10 ⁵細胞で行わ播種し、37℃で一晩加湿インキュベータ内に配置されます。
8. 翌日、細胞や広告からメディアを削除するウイルスストックのD 1mlを各ウェルに4μlのポリブレン（濃度2μg/ mL）で補った。インキュベーター内でプレートを交換してください。
9. 5〜6時間以下のインキュベーション、各ウェルプレートに2 mlの1....

ディスカッション

マトリゲル浸潤アッセイは、従来、化学誘引物質誘発性運動性に向かってとし、下部のフィルタを通して細胞外マトリックス蛋白質の層の上に置かれた細胞を使用して設定されています。侵襲性がフィルターの下側にカウントできるセルの数の関数として採点した。上記の"逆"浸潤アッセイでほとんど差が実質的にあるが、彼らはマトリゲルを通って移動して浸潤細胞を可視化することにより決定することができる侵入のプロセスについてかなり多くの情報があります。例えば、集団の侵略（図3C及び3D）につながる対後の細胞を調べるために異なる方法で標識された細胞を可視化できることに加えて、このメソッドを使用しても、細胞を固定できるようにする、透過性、染色後、タンパク質レベルまたは細胞内分布のために撮像。この方式の分解能は蛍光を発するのベースラインの信号強度によって制限されるNTのタンパク質は、2つ以上の色がイメージを作成する場合は特に、細胞および撮像装置の感度を表現。染料急冷（DQ）コラーゲン（タンパク質分解は、それによって地元のフルオレセイン濃度を低下させ、蛍光を許可するコラーゲン断片を分離するまで蛍光信号を消光されるフルオレセインを持つように強く結合したもの）.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号
DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）	GIBCO	21969
ウシ胎仔血清	PAA	A15 - 101
ペニシリンストレプトマイシン	GIBCO	15140
200mMのL -グルタミン（100倍）	GIBCO	25050-032
ピューロマイシン	シグマアルドリッチ	P8833
0.05％トリプシンEDTA	GIBCO	25300
ポリブレン	シグマアルドリッチ	AL - 118
リポフェクトアミン2000試薬	インビトロジェン	11668019
6.5ミリメートルTranswells、8.0μmの孔径	コーニング	3422
完全なマトリ	BDバイオサイエンス	354234
カルセインAM	インビトロジェン	C1430
RNaseの	キアゲン	19101
ヨウ化プロピジウム	シグマアルドリッチ	P4864
共焦点microcope	ライカ	SP2MP